蛋白质含量测定方法的比较.docx

蛋白质含量测定方法的比较蛋白质含量测定方法的比较第３１卷第４期２００８年０４月Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４Ａｐｒ．２００８第一文库网蛋白质含量测定方法的比较郭颖娜，孙（华北制药股份有限公司，河北［摘卫石家庄０５００２７）存在和进化都密切相关，蛋白质含量测定涉及到生产和科研的众多领域。目前常用的方法有要］蛋白质与生命的起源、凯氏定氮法、双缩脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。本文总结各种方法的特点及适用条件，针对不同的待测样品以及对测定结果准确性的要求不同，我们可以采用不同的方法来测定样品中蛋白质的含量。［关键词］蛋白质；凯氏定氮法；双缩脲法；紫外吸收法；考马斯亮蓝法［中图分类号］ＴＳ２１２．７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００３－５０９５（２００８）０４－００３６－０２蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）。其中Ｂｒａｄｆｏｒｄ法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏１０～２０倍，比Ｂｉｕｒｅｔ法灵敏１００倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这４种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间。１凯氏定氮法１．１原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定４个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。１．２特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜２．５０ｇ，硫酸钾０．１０ｇ，浓硫酸４．００ｍＬ；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素，硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验，消化时间仅为［收稿日期］２００８－０２－１３［作者简介］郭颖娜（１９７９－），女，助理工程师，从事质检工作。１２ｍｉｎ；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比，该法所需消化时间最短，试剂用量减少，可降低实验成本，也降低了对环境的污染。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置，可同时测定几份样品，节省时间，提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定，具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。２双缩脲法（Ｂｉｕｒｅｔ）２．１原理双缩脲（ＮＨ３ＣＯＮＨＣＯＮＨ３）是两个分子脲经１８０℃左右加热，放出１个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与ＣｕＳＯ４形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以１个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。２．２特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响，采用０．５ｇ样品，４０ｍＬ双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为１～２０ｍｇ蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。３紫外吸收法３．１原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性第４期郭颖娜孙卫：蛋白质含量测定方法的比较?３７?质，吸收峰在２８０ｎｍ处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在２３８ｎｍ的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。３．２特点最常用的紫外吸收法是２８０ｎｍ的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用２８０和２６０ｎｍ的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用２１５与２２５ｎｍ的吸收差法。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差，故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干