一种木麻黄的种质资源离体保存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112868528A(43)申请公布日2021.06.01(21)申请号202110122750.6(22)申请日2021.01.29(71)申请人湛江市林业科学研究所（广东省（湛江）区域性林业试验中心、湛江市林业科技推广中心）地址524000广东省湛江市赤坎寸金三横路5号(72)发明人容世清罗建华吴章丽曾少玲黄良宙李天卓余正国梁庆华(74)专利代理机构广州市南锋专利事务所有限公司44228代理人李慧(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页(54)发明名称一种木麻黄的种质资源离体保存方法(57)摘要本发明公开了一种木麻黄的种质资源离体保存方法，以木麻黄植株幼嫩木质化枝条作为外植体，将木麻黄枝条彻底清洗干净，然后进行灭菌，从灭菌后的木麻黄枝条切取1‑3cm茎段，接入启动培养基中进行启动培养，5‑30天后转到扩繁培养基中进行扩繁培养10‑30天，然后转入保存培养基中于温度1‑15℃和光照200‑1000Lux条件下进行保存；本发明提出的木麻黄的种质资源离体保存方法建立了木麻黄种质资源保存的无菌体系，采取组织培养，有效脱除潜伏在木麻黄中病毒性病害，实现真正无病害种质资源保存，具有遗传性状稳定，培养过程简单，保证了种质基因的完全保留。CN112868528ACN112868528A权利要求书1/1页1.一种木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养基的配制：包括基本培养基和离体各阶段的培养基：a)MS培养基：每升MS培养基中含有无机添加物KNO31650‑2150mg、NH4NO31420‑1740mg、MgSO4·7H2O295‑382mg、KH2PO4156‑183mg、CaCl2·2H2O367‑428mg、Na2‑EDTA·2H2O32.6‑42.50mg、FeSO4·7H2O28.67‑40.22mg、FeSO4·4H2O19.80‑32.43mg、MnSO4·H2O13.64‑19.75mg、MnSO4·4H2O18.74‑27.75mg、ZnSO4·7H2O6.88‑10.32mg、H2BO35.96‑7.24mg、KI0.66‑0.96mg、Na2MoO4·2H2O0.20‑0.30mg、CuSO4·5H2O0.020‑0.033mg、CoCl2·6H2O0.020‑0.035mg，含有有机添加物肌醇80‑120mg、烟酸0.4‑0.6mg、甘氨酸1.8‑2.5mg、盐酸吡哆醇B60.4‑0.6mg和盐酸硫胺素B10.08‑0.12mg；b)启动培养基：包括MS+6‑BA1‑3mg/L+NAA0.01‑0.5mg/L+蔗糖20‑50g/L+植物凝胶3g/L,PH值为5.6‑6.0；c)扩繁培养基：包括MS+6‑BA0.2‑0.8mg/L+NAA0.1‑0.5mg/L+蔗糖10‑40g/L+植物凝胶2‑5g/L,PH值为5.6‑6.0；d)保存培养基：包括1/4MS+多效唑0.05‑0.5mg/L+6‑BA0.1‑0.5mg/L+蔗糖10‑50g/L+植物凝胶1.5‑5.5g/L,PH值为5.6‑6.0；(2)清洗和灭菌：将木麻黄枝条彻底清洗干净，然后进行灭菌；(3)离体培养：从灭菌后的木麻黄枝条切取1‑3cm茎段，接入启动培养基中进行启动培养，5‑30天后转到扩繁培养基中进行扩繁培养10‑30天，再转入保存培养基中；(4)离体保存：将转入试管苗的保存培养基于温度1‑15℃和光照200‑1000Lux条件下进行保存，每天光照2‑12h。2.根据权利要求1所述的木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述的木麻黄枝条取自两年生以上木麻黄植株的基部萌蘖枝条。3.根据权利要求1所述的木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述的灭菌过程包括分别用质量浓度为50‑80％的乙醇、0.2‑0.5％的苯扎溴铵、1‑4％的次氯酸钠依次浸泡灭菌10‑60s、5‑30min、5‑20min，无菌水冲洗2‑5次，再用0.1‑0.5％的氯化汞灭菌3‑10min，无菌水冲洗3‑5次。4.根据权利要求3所述的木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述的灭菌过程包括分别用质量浓度为70％的乙醇、0.3％的苯扎溴铵、3％的次氯酸钠依次浸泡灭菌10‑60s、5‑30min、5‑20min，无菌水冲洗2‑5次，再用0.3％的氯化汞灭菌3‑10min，无菌水冲洗3‑5次。5.根据权利要求1所述的木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述的茎段为选自顶芽或带有腋芽的茎段。6.根据权利要求1所述的木麻黄的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述1/4MS培养基是大量元素为MS配方量的1/4。2CN11286852