一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107079813A(43)申请公布日2017.08.22(21)申请号201710264016.7(22)申请日2017.04.21(71)申请人山东省农作物种质资源中心地址250100山东省济南市工业北路202号(72)发明人颜廷进田茜邓翠霞戴双李群(74)专利代理机构北京中济纬天专利代理有限公司11429代理人陈晓蕾(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)A01N3/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法(57)摘要本发明公开了一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于原球茎诱导培养基表面培养成原球茎，将原球茎进行反复切割和继代培养，从而繁殖出所需数量的原球茎，然后采用离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在0～5℃条件下暗培养；将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗。本发明利用建兰茎尖培养技术，诱导出原球茎，然后通过原球茎分化获得建兰幼苗。低温保存原球茎，结合添加适量多效唑，可以大大延长保存时间，减少继代培养次数，有效保持了种质资源的遗传特性。保存一定时间后，置于正常温度和光照条件下培养，能迅速恢复生长，分化出幼苗。CN107079813ACN107079813A权利要求书1/1页1.一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于VW培养基辅以0.5～1mg/L6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎，将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为VW培养基辅以0.2～0.4mg/L6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎，然后采用VW培养基辅以2.5mg/L多效唑的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在0～5℃条件下暗培养。2.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，所述茎尖的剥取方法如下：选择长度为5～7cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的1～2个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗3～4秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗3～4次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。3.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。4.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。5.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，反复切割和继代培养的具体方法是：将生长为4～6mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。6.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，所述发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。7.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。8.根据权利要求1所述的一种建兰种质资源离体保存方法，其特征在于，暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好，以减少离体保存培养基中水分的挥发。9.权利要求1～8所述离体保存方法保存后恢复生长的方法，其特征在于，将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为KC培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。10.根据权利要求9所述的保存后恢复生长的方法，其特征在于，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第2～3片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有2～3条根，5～6片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。2CN107079813A说明书1/6页一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法技术领域[0001]本发明涉及一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法。属于植物组织培养技术领