一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106520697A(43)申请公布日2017.03.22(21)申请号201610919690.X(22)申请日2016.10.21(71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433上海市杨浦区翔殷路800号(72)发明人崔淑芳杨文静程继帅徐晨林丽芳蔡丽萍李周桐丛薇余琛琳赵善民(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)31268代理人赵青(51)Int.Cl.C12N5/0793(2010.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法(57)摘要本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法。本发明综合使用多种培养基从胚胎期裸鼹鼠脊髓分离并纯化培养DRG神经元，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠DRG神经元的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠DRG神经元，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠DRG神经元的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。CN106520697ACN106520697A权利要求书1/1页1.一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠DRG混合神经细胞：分离胚胎期55-60天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I混匀之后消化，再用组织消化液II消化；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；所述的组织消化液I为含有0.1％胶原酶和0.06mg/mlDNA酶I的混合液；所述的组织消化液II为含有0.125％胰蛋白酶和0.06mg/mlDNA酶I的混合液所述的基质层为右旋多聚赖氨酸基质层并覆盖以胶原蛋白基质层；B、裸鼹鼠DRG混合神经细胞的培养：将步骤A得到的DRG混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养10-15小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养1-3天，然后再更换为神经元维持培养基培养1-3天，如此为一个循环，培养3-5个循环；所述的混合神经细胞培养基为含有体积百分数为10％进口胎牛血清的低糖DMEM；所述的神经元纯化培养基为含有10μM5-氟尿嘧啶的Nerobasal培养基并添加体积百分数为2％的B27；所述的神经元维持培养基为含有体积分数为2％B27的Neurobasal培养基，同时添加120ng/mlNGF；所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5±0.5％，湿度为96±2％。2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm3，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化15min。3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤A中，用3ml混合神经细胞培养基终止消化。4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于步骤B中，用混合神经细胞培养基培养12小时，待其完全贴壁之后，更换为神经元纯化培养基继续培养2天，再更换为神经元维持培养基培养2天，如此为一个循环，培养3个循环。5.根据权利要求1所述的裸鼹鼠DRG神经元培养方法，其特征在于，步骤B中所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为15％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。2CN106520697A说明书1/6页一种裸鼹鼠DRG神经元培养方法技术领域[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域，具体地说，是一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠DRG神经元的分离纯化和培养方法。背景技术[0002]慢性疼痛严重影响着人类的生活质量，亟待有效的治疗措施。DRG神经元作为体内重要的感觉神经元，在疼痛的发生发展过程中发挥主要作用(VallejoR,TilleyDM,DL,KelleyCA,DeMaegdM,BenyaminR.GenomicsoftheEffectofSpinalCordStimulationonanAnimalModelofNeuropathicPain.Neuromodulation.2016Jul8.doi:10.1111/ner.12465.)。因此，深入揭示DRG神经元生理学功能及特点将有利于阐明DRG神经元的功能以及其在神经系统疾病发生发展中的作用。[0003]裸鼹鼠是一种变温哺乳动物，在氧气浓度