一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106754716A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201610919420.9(22)申请日2016.10.21(71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433上海市杨浦区翔殷路800号(72)发明人崔淑芳杨文静孙伟程继帅林丽芳丛薇蔡丽萍余琛琳赵善民徐晨李周桐(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)31268代理人赵青(51)Int.Cl.C12N5/079(2010.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法(57)摘要本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种裸鼹鼠雪旺细胞的分离纯化和培养方法。本发明综合使用多种培养基从裸鼹鼠胎鼠脊髓DRG神经节中分离并纯化培养雪旺细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠雪旺细胞的合理培养方法。本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠雪旺细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠雪旺细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。CN106754716ACN106754716A权利要求书1/1页1.一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A、收集裸鼹鼠DRG混合神经细胞：分离胚胎期58-65天的裸鼹鼠脊髓DRG神经节，将DRG神经节剪碎，加入组织消化液I混匀之后消化，再用组织消化液II消化；然后用混合神经细胞培养基终止消化，离心去除上清之后，在混合神经细胞培养基中将沉淀重悬并吹打成单细胞悬液；将单细胞悬液种于无菌且预先包被有基质层的培养板中；所述的组织消化液I为含有0.15％胶原酶和0.03mg/mlDNA酶I的混合液；所述的组织消化液II为含有0.25％胰酶和0.03mg/mlDNA酶I的混合液；所述的基质层为左旋多聚赖氨酸的基质层；B、裸鼹鼠DRG混合神经细胞的培养：将步骤A得到的DRG混合神经细胞，用混合神经细胞培养基培养于三气培养箱中培养24小时后更换新鲜的混合神经细胞培养基，之后每3天换一次培养基；培养25天后换为雪旺细胞纯化培养基进行培养，每三天更新一次培养基；所述的混合神经细胞培养基为含有体积百分数为15％进口胎牛血清的低糖DMEM培养基；所述的雪旺细胞纯化培养基为含体积分数为2％B27的Neurobasal并添加质量体积分数为0.01mg/ml的PDGFa；所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35±2℃，氧浓度为6％，二氧化碳浓度为5±2％，湿度为96±2％。2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，用显微剪将神经节组织剪碎至1mm3，加入组织消化液I混匀之后，于37℃消化30min，再用组织消化液II于37℃消化30min。3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤A中，用2ml混合神经细胞培养基终止消化。4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基培养24小时，待其完全贴壁之后，更换新鲜的混合神经细胞培养基，之后每3天更换一次培养基。5.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤B中所述的三气培养箱的参数设置为：温度控制在35℃，氧浓度为6％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。6.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤A中所述的左旋多聚赖氨酸浓度为0.01mg/ml。7.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤A中所述的离心参数设置为室温下，1000rpm，5分钟。8.根据权利要求1所述的裸鼹鼠雪旺细胞培养方法，其特征在于，步骤B中，用混合神经细胞培养基中培养于三气培养箱中31天。2CN106754716A说明书1/5页一种裸鼹鼠雪旺细胞培养方法技术领域[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，特别涉及一种裸鼹鼠雪旺细胞的分离纯化和培养方法。背景技术[0002]雪旺细胞(Schwanncell)是脊髓的成髓鞘细胞，其包绕神经元轴突形成的髓鞘结构对神经元有营养、支持及保护作用，并且髓鞘的存在能够保证神经元之间信息传递的速率。未成熟的雪旺细胞可以受到微环境的刺激而再次启动分化。在脊髓横断损伤、肌肉萎缩性侧面硬化病等疾病中一般会伴随有髓鞘的损伤(BilliardsSS,HaynesRL,FolkerthRD,BorensteinNS,TrachtenbergFL,RowitchDH,LigonKL,VolpeJJ,KinneyHC.2008.Mye