最新精编医学专题—细胞凋亡检测方法.docx

11细胞凋亡检测方法一、细胞凋亡的形态学检测1光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形全面皱缩细胞膜完整但出现发泡现象细胞凋亡晚期可见凋亡小体凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2）染色细胞：姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞）正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Hoechst33342Hoechst33258DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性用于常规固定细胞的染色。PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜Hoechst则为膜通透性荧光染料故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形淡兰色内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色或核呈分叶碎片状边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色或核呈分叶状边集的Hoechst着色的为调亡细胞。凋亡细胞体积变小细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块产生凋亡小体(图1)。3透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期细胞核裂解为碎块产生凋亡小体。二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（PhosphatidylserinePS）正常位于细胞膜内侧但在细胞凋亡早期PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白能与PS高亲和力特异性结合细胞处于调亡或坏死时Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性）是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记以标记了的Annexin-V作为荧光探针利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。PI和Annexin-V双标：碘化丙啶(propidineiodidePI)是一种核酸染料它不能透过完整的细胞膜但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。*注意：细胞凋亡时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。活细胞不能被AnnexinV-FITC或PI染色（右图左下象限）。早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜故呈AnnexinV-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。坏死或晚期凋亡的细胞呈AnnexinV-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。三、线粒体膜电位的检测线粒体跨膜电位下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前一旦线粒体DYmt崩溃则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。名称检测原理33’-Dihexyloxacarbocyanineiodide（DiOC6）一种有细胞通透性及电压敏感性的亲脂性阳离子荧光染料