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HeilongjiangAnimalScience
24andVetefina~MedicineNo112011

实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用

徐楠楠，胡桂学
(吉林农业大学动物科技学院，长春130118)

中图分类号：$813．3文献标识码：A文章编号：1004—7034(2011)11—0024一O4

聚合酶链反应(PCR)技术自1985年问世以来，品的值，即可从标准曲线上推算出该样品的起始
以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科拷贝数。
研领域得到了广泛应用。但是，由于传统的PCR技2实时荧光定量PCR的检测方法
术不能准确定量，在操作过程中易受污染而使假阳性随着分子生物学技术的不断发展，迄今已建立了

率偏高；因此，使其应用受到限制。实时荧光定量一系列的实时定量PCR技术检测方法。具体包括2
PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量大类，即探针类和染料类。探针类是利用与靶序列特
准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物异杂交的探针来指示扩增产物的增加；染料类如
学研究的重要工具。文章对实时荧光定量PCR技术SYBRGreenI则是利用与双链DNA小沟结合发光
的原理、检测方法、定量方法及其应用进行了综述。的理化特征指示扩增产物的增加。
1实时荧光定量PCR的原理2．1Taqman探针
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系该探针是长度为20～24bp的寡核苷酸，在其5
中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个末端标记1个荧光报告基团，3末端标记1个荧光淬
PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量灭基团，其序列与2个引物包含序列内的1段DNA
分析的方法¨J。在荧光定量PCR中，对整个PCR反模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用
应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号，随着Taq酶(5一3外切酶)的活性淬灭基团吸收发射的
反应时间的延续，监测到的荧光信号可以绘制成一条荧光。当有特异的而不是非特异的PCR发生时，Taq
曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背酶同时发挥其5一3外切酶活性，将与模板杂交的探
景明显区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和针切碎，报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用被解除，
最终的平台期，在PER反应处于指数期的某一点检荧光信号释放，通过检测系统就可以观察到信号的变
测PCR产物的量，并由此可以推断模板最初的含化，荧光信号的累积与PCR产物形成呈正相关。每
量]。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝扩增1条DNA链，就有1个游离的荧光分子形成，实
数，荧光定量PCR采用参数“c”值，值(cycle现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
threshold)是指每个反应管内的荧光信号到达设定的利用标准模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的
阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的值，可以确定样品的起初模板量J。由于探针与
值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始目标片段之间的特异杂交产生荧光信号，因而此方法
拷贝数越多，c值越小J。利用已知起始拷贝数的可通过探针增强检测的特异性，且能够提供多重检测
标准品可以绘制出标准曲线；因此，只要获得未知样功能。但Taqman探针检}贝0法也存在一定的不足，如
淬灭难以彻底、本底较高、定量时容易受酶活性的影

收稿日期：2010—12—13；修回日期：2011—09—07响、探针成本较高等使其无法普及应用。
作者简介：徐楠楠(1983一)，女，硕士研究生，1211443@sina．2．2TaqmanMGB探针

eom．TaqmanMGB探针是在Taqman探针的基础上改
通信作者：胡桂学(1963一)，男，教授，博士，博士生导师，hu—进的，在探针的3端增加了小槽黏结剂(MGB)分子，
[e-mail]．这种物质能够结合在双链DNA小沟部位。MGB可

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《黑龙江畜牧兽医》科技版2011年11月(上)25

将探针的TM值提高10℃左右，从而使其能够分辨有模板存在时，2个