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国外医学临床生物化学与检验学分册生箜鲞箜塑327

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·免疫学及其它·
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

张蓓综述，沈立松审校
(上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心实验诊断中心，上海200127)

摘要：多聚酶链反应飞速的发展使其成为了分子生物学实验室重要的工具，实时荧光定量PCR(real-timequantitative
PCR)技术以其敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一步。本文对real-timeQ-PCR技术的原理、五种
主要的荧光化学及定量方法作一介绍，同时也讨论了此技术存在的不足，并对其目前在研究领域中主要的应用进行了概述。
关键词：实时多聚酶链反应(real—timePCR)；荧光；定量；临床应用
中图分类号：R446，6文献标识码：A文章编号：1006—3730(2003)06—0327—03

多聚酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)技术发明该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，
至今已近2O年了，在这期间其技术得到了不断的发展，近年来Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，
出现的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术实因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该
现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、样品的起始拷贝数。
重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生1．2荧光化学目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方
物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，
荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特
1实时荧光定量PCR技术的方法学
异的检测两大类。
1．1原理所谓real—timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光
系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进分子．如SYBRgreen1『3等荧光染料。Real—timeQ-PCR发展
程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过
real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作量sYBRgreen1荧光染料，sYBRgreen1荧光染料特异性地
用_1]：(1)在9O年代早期，TaqDNA多聚酶的5核酸外切酶活掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能
性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接的检监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方
测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染

一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如
结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体
PCR方法在研究工作中的运用。的问题目前可以用带有熔解曲线(meltingcurve)分析的软件
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加加以解决。
的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光
成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法
离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略n]。目前在
终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-timeQ-real-timeQ-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这
PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性
地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧
荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产光基团和一个淬灭荧光基团，此时5端荧光基团吸收能量后将
生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指能量转移给ll缶近的3端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转
数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5端荧光基团发
期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火
初的含量『2]。为了便于对所检测样本进行比较，在re