实时荧光定量PCR概述.ppt

实时荧光定量PCR技术研究概述诞生原理2、探针类（TaqMan探针法）方法按荧光产生的原理有两种方法：荧光探针法和荧光染料法。

染料法利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR类似，唯一区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。

探针法：与常规PCR的不同之处在于：在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比，提高了实验的特异性。目前市场上探针多样，其中以TaqMan探针应用最为广泛。
荧光素：FAM、Texasred、LC-Red640，LC-Red705等

5、标准品的制备2024/11/28(2)、反应条件的设定

95℃预变性2min
↓
94℃变性30s
↓
55-65℃退火30s
↓
72℃延伸30s
↓
72℃终延伸5min

扩增30-40个循环

(3)、反应体系和条件的优化

♦酶浓度

♦Mg+浓度

♦dNTP浓度

♦上、下游引物浓度

♦探针浓度

♦退火温度、退火时间和循环数

♦DNA模板浓度

6、荧光曲线与标准曲线的制作2024/11/287、待测品的制备
将待测样品放置在与标准品相同优化后的体系、条件下进行PCR扩增反应。

8、通过标准曲线进行数据分析
待测样品的CT值可通过标准曲线方程CT×a=-lgX0+b
求得待测样品的起始模板数,从而达到通过标准曲线对未知模板进行定量分析的效果。荧光PCR的应用2.病原体检测采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。关于实时荧光定量PCR的相关问题优点减少污染：定量而荧光定量PCR由于利用扩增进入指数增长期的Ct值来定量起始模板的数量实现了精确的核酸定量检测有效地避免了污染，传统的PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果，除了易造成污染外，还对人体有害，而荧光实时定量PCR在闭管状态下实现扩增及产物分析，有效地减少了污染及对人体的危害，在大批量的标本检测中能有效地减少劳动量，提高检测通量和实现快速检测。仍需改进之处ThanksForwatching！