荧光定量PCR的概述.doc

(完整word)荧光定量PCR的概述(完整word)荧光定量PCR的概述(完整word)荧光定量PCR的概述Real—timeqPCR手册--—手把手教你从菜鸟到高手由于Real-timeqPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real—timeqPCR所代替。由于real—timeaPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测,很多没有做过real-timeqPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从real-timeqPCR的发展史说起,包括real-timeqPCR的原理，实验设计,实际操作，数据分析,常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-timeqPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real—timeqPCR发展史Real-timeqPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据.由于常规的PCR的缺点，real-timeqPCR由于其操作简便,灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速.现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测,药物开发，临床诊断，转基因研究等。在Real—timeqPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析.从而荧光定量PCR获得广泛应用.现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO—RAD的CFX96、iCycleriQ5@、MyiQ@、MJResearchChromo4TMOpticon系列；StratageneMxTM系列；RocheLightCycler＠系列;EppendorfMasercycler＠;CorbettRotor—GeneTM；CepheidSmartCycler＠和BIOER的LineGene系列.随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事.与其同时,国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real—timePCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器.二、Real—timeqPCR概述1。Real—timeqPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测.一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成.其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统.有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅.在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值.2。Real—timeqPCR的数学原理首先来看一个real—timeqPCR中的重要参数Ct值（Ctvalue），阈值（threshold），和基线(baseline）.一般来讲,第3—15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数.所以是一个没有单位的参数。那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢？我们来看PCR的扩增方程:从线性方程上看，斜率（slope）为—1/lg（1+E），所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3。3），就可以算出扩增效率（0.99)。一般来讲PCR扩增效率在90％—110%都是可以用于数据分析的。效率低于100％，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100％可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。3。Real—timeqPCR的种类根据real—timeqPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan＠探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类,其中包括如SYBR@GreenI或者特殊设计