实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择.pdf

临床检验杂志2005年第23卷第5期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience，2005，Vo1．23，No．5393

文章编号：1001-764X{2005)05-0393-03中图分类号：R394．3文献标识码：A·综述与进展·
实时荧光定量RT—PCR内参基因的选择

陈凤花，王琳综述，胡丽华审校(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉430022)

关键词：实时荧光定量RT-PCR；内参基因

实时荧光定量RT-PCR(real—timefluorescentquantitative达，排除太高或低表达；③稳定表达于不同类型的细胞和组
reversetranscription-polymerasechainreaction，FQRT—PCR)是织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著
检测低丰度mRNA的敏感方法，为了去除不同标本在RNA性差别；④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；⑤
的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标其稳定的表达水平与目标基因相似；⑥不受任何内源性或外
基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。排除内
校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产参基因的条件则为：①在正常和异常的细胞／组织中的表达
量、质量和／或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基存在差异；②呈现细胞周期依赖的表达；③定位于x染色体。
因以减少检测标本间的差异是必须的。本文就FQRT．PCR内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成性表达，
内参基因的选择作一简要综述。有助于保持细胞的功能。看家基因在某些类型细胞中的表
1内参基因应具备的条件达是恒定的，但在其他类型的细胞中则是变化的，尤其是与
理想的内参基因应该满足以下条件：①不存在假基因恶性疾病相关的临床标本。常用的人类内参基因见表
(pseudogene)，以避免基因组DNA的扩增；②高度或中度表1。

表1常用内参基因

2常用内参基因的缺陷殖和器官发育的不同阶段、体外培养、各种实验条件等情况
90％以上的RT·PCR应用单一的内参基因来校正与标下，它们的表达量通常变异较大。
准化目标基因的表达，其中最常用的包括GAPDH、13-actin、2．1GAPDHGAPDHmRNA在不同癌组织(包括肺癌、乳
18SrRNA和28SrRNA等。近年来的研究发现，这些常腺癌、肾细胞癌等)中的表达升高，在不同个体间、怀孕期
用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织、细胞增间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在正常的结肠上

作者简介：陈凤花，1979年生，女，在读博士，主要从事血液学研究，E-mail：[e-mail]。
通讯作者：胡丽华，教授，博士生导师，主要从事输血学和肿瘤诊断研究。

394临床检验杂志2005年第23卷第5期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience，2005，Vo1．23，No．5

皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变能不存在。正确选择内参基因，很大程度上依赖于所
化。在各种因素(例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮研究的细胞或组织，研究者应寻找适合各自实验系统的特异
生长因子等)刺激下，培养细胞GAPDHmRNA的表达水平也性稳定表达的内参基因。因此，适当内参基因的选择，需要
不同。在每种类型的细胞、每种类型的肿瘤和每种实验条件下进
2．2B．actin当细胞向恶性转化时，p-actinmRNA的表达行。
水平增加；而假基因的的存在也可干扰B-actin的检测。Kim等训对67例肝组织研究，发现UBC和HMBS对于
2．318SrRNA和28SrRNA有些学者认为28SrRNA和实时定量RT—PCR分析是最准确的标准化因子，提示这2种
18SrRNA不是适合的内参基因。由于rRNA是由一种不看家基因对于肝组织的表达分析是最佳选择。Lupberger
同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成，前者是由RNA聚合等应用FQRT．PCR研究不同标本中3种常用内参基因B—
酶I，后者是由RNA聚合酶Ⅱ。因此rRNA合成的调节独立aetin、B．MG和PBGD的表达变化，在白血病细胞系K562
于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种rRNA水平中，3者的表达量依次为1544±246、65±30和22±8拷贝／
很少发生变化。然而，rRNA的转录易受到各种生物因素和每个细胞；在正常人的白细胞中，三者的表达量依次为491±
药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18SrRNA明显减少或97、40±17和<1拷贝／每个细胞；