实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择.pdf

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鑫Tr墓sI蒜Io志H濡Lo器v。1．26实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择Yn—N矗，HA0综述李雅楠1，郝玉宾2，张志3，戴二黑3SelectionGeneforRT—qPCRCirculatingmicroRNA小RNA，具有高度的遗传稳定性。它通过与靶7uTR)特异性结合，诱导靶mRNA降解或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达¨。“。2008年，Lawrie等”1首次报道miRNA可稳定存在于血清、血浆等体液中，称之为循环miRNA，的影响，具有良好的稳定性，这些优点使其成为研究打谱技术等高通量检测技术已广泛应用于循环miRNA的初步筛查，但高灵敏性、宽动态范围及低样本量的要求使得实时荧光定量PcR(real—timePCR，RT—qPcR)仍是验证循环miRNA表达变化的确证实验隅“01。RT—qPCR受miRNA提取、初始模板量、转录效率等多种因素影响，而且血准确性，是目前应用RT—qPcR技术进行循环miRNA相对定量亟需解决的关键问题。目前，使用的循环miRNA内参大致可分为3类：非编码RNA、人工掺人ofEndogenousReferenceAnalysisLeVelsYu—B衍，ZHANGZ酣，DAlmicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物体内，长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链微mRNA的37非翻译区(3并发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中miRNA表达水平改变。随后大量实验证明，在多种疾病状态下循环miRNA表达谱改变，具有疾病诊断、疗效评价及预后判断等潜在临床价值”“1。循环miRNA易获取，不受高温、极端pH值、长期储存、反复冻融热点”，。微阵列芯片、Solexa序列分析、基于磁珠的液中循环miRNA表达量低，样本间差异较大，选择不同的内参，相对定量结果不同，甚至截然相反n”。因此，找到合适的内参校正转录效率和cDNA用量，弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别，提高检测的外源miRNA和表达稳定的循环miRNA。现将其各自的特点总结如下。doi：10．3969／j．issn．1009—0002．2015．01．0321．河北医科大学，河北石家庄050017；2．河北省人民医院，河北石家庄050051；3．河北省石家庄市第五医院，河北石家庄050021[摘要]micmRNA(miRNA)是一类内源性非编码微小RNA，在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。研究发现，miRNA能够稳定存在于细胞外液，被称为循环miRNA。在多种疾病状态下循环miRNA表达谱改变，具有成为非创伤性新型生物标志物的潜能。实时荧光定量PCR(RT—qPcR)是检测miRNA表达变化的确证实验，其中内参的选择关系到相对定量结果是否真实可靠。我们简要综述国内外实验室常用的RT—qPcR内参及其特点。[关键词]循环miRNA；实时荧光定量PCR；内参[中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2015)0卜0146—03Er—He}卑University，ShijiazhuangHospital，ShijiazhuangShijiazhuang，Shijiazhuang[Abstract]majorquantifying[Keywords]146Jan．，2015LImicmRNA(miRNA)are收稿日期：2014—08—04基金项目：国家“十二五”科技重大专项(2013zxl0003002一004)；河北省卫生厅科研基金(2叭30650)作者简介：李雅楠(1989一)，女，硕士研究生通信作者：戴二黑，(E—mail)[e-mail]050017；2．HebeiGeneral050051；3．theFifthHospital050021；ChinaclasssmallendogenousnoncodingRNAmoleculethatparticipatebiologicalprocesses，suchcellprolifbmtion，diffbrentiationandapoptosis．RecentstudiesindicatemiR-NAstablyexistinextracellularnuid，thatcirculatingmiRNA．TheprofilesmiRNAchangeundertheconditiondiseasesmakesbiomarkerdisease．ThegoldstandardmethodologyfbrisRT—qPcRsuitablereferenceimportanceresults．Th