酸性磷酸酯酶组织定位.docx

酸性磷酸酯酶的组织定位
一、目的
1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤;
2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。

二、原理
酸性磷酸酯酶(AcidPhosphatase)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。
PO43-+Pb(NO3)2-----Pb3(PO4)2↓（沉淀）
Pb3(PO4)2+(NH4)2S----PbS↓(棕黑色)
三、实验材料、试剂和仪器
1、材料
新鲜蒜苔，新鲜青菜的全根系组织；
2、试剂
磷酸缓冲液PH=7.2，丙酮，底物溶液，(NH4)2S试剂，邻苯二酚，蒸馏水等
3、仪器和用具
恒温水箱、显微镜、烧杯、大小培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸等等。

四、实验方法与步骤
1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：
A.徒手切片蒜苔（使切片尽量薄而透明），将切片放入装有干净蒸馏水的培养皿中备用；
B.挑选适宜的蒜苔切片，将其放入4℃的丙酮中，固定15min后用蒸馏水清晰切片1-2次；
C.将洗好的切片移入装有底物溶液的试管中，在37℃下水浴1h；
D.水浴完成后，将切片用蒸馏水洗3次，加入0.5%的(NH4)2S溶液，放置1-2min后，再次用水将切片洗净；
E.将切片转移至载玻片上后，进行镜检。
2、新鲜青菜根系的酸性磷酸酶组织定位：
A.将完整的青菜根系用蒸馏水清洗干净，放入装有PBS（磷酸缓冲液，PH=7.2）的烧杯中，在室温下放置5min；
B.将根系放入1%的邻苯二酚液中，在37℃下水浴1h-2h;
C.水浴过后将根系取出，观察并拍照。

五、实验结果与分析
1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：
■将蒜苔进行徒手切片：

■将切片放入底物溶液中进行水浴：

■在10×的放大倍数下对切片进行观察：
在视野中很明显有棕黑色的地方，说明蒜苔切片中酸性磷酸酶的主要分布区即为如图所示的棕色部分。

■在40×的放大倍数下对切片进行观察：
观察到在蒜苔细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色沉淀。也有部分细胞呈现阴性反应。

2、新鲜青菜根系的酸性磷酸酶组织定位：
■将根系加入邻苯二酚中进行水浴：

■加入邻苯二酚的根系（左）与自然状态下根系（右）进行对比：
我们可以很容易地观察到左边的根系颜色明显为棕红色或褐色，而右边的自然状态下的根系颜色较白。这说明在对新鲜青菜根系中的酸性磷酸酶进行定位时，磷酸酶主要存在的地方为为图中的红棕色部分。