酸性磷酸酯酶基础实验.docx

实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定
[原理]
酸性磷酸酯酶（AcidphosphataseE.C..2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
图酶反应进程曲线
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。

[试剂和器材]
1、试剂：
（1）酸性磷酸酯酶原酶液
取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3000r/min离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3000r/min离心30min，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。
（2）酸性磷酸酯酶液
取原酶液，用0.05mol/LpH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6—0.7之间。
（3）1.2mmol/L对-硝基苯磷酸酯（NPP）
精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至1000mL。
（4）0.3mol/LNaOH。

2、器材：
（1）恒温水浴槽
（2）可见光分光光度计
（3）试管、刻度吸管

[方法和步骤]
取试管12支，按下表编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mmol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35℃恒温水浴槽中预热2分钟。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50分钟进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL0.3mol/LNaOH终止反应。冷却后以0号管作空白，在分光光度计上测定各管A405值。
管号
试剂12345678910110*对硝基苯磷酸酯（NPP）（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0稀释酶液（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0反应时间（min）3571012152025304050250.3mol/LNaOH（mL）3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0*0号管加入1.0mLNPP后保温25分钟，然后加入3mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液。

[数据处理]
以反应时间为横坐标，A405为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

实验二pH对酶活力的影响——最适pH的测定
[原理]
pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH，因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力；一种酶在不同pH条件下所表现出来的活性不同。
pH之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合；而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的结合，酶活力也相应降低。pH也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解离。缓冲系统的离子性质和离子强度，也可能对酶反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。
本实验测定pH对酸性磷酸酯酶活性的影响并测定最适pH。

[试剂和器材]
1、试剂
酸性磷酸酯酶原酶液
（2）酸性磷酸酯酶