实时定量PCR完全手册.docx

方法简介
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成
1、反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA
2、扩增:用PCR的方法扩增cDNA
3、检测:实时检测和定量扩增的产物
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Keyporint)
1、分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2、反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3、数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1、.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2、整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3、总RNA或者mRNA
4、RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5、不同的酶以及酶的不同组合
6、变异系数、灵敏度
7、多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8、每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA质量评价
现在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse()比较了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA质量
RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28SrRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligodT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
是否有抑制物的评价体系：
1、通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2、.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3、用细菌检测临床样品的抑制
4、通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1、RT和PCR单一酶系统
2、RT和PCR分离的酶系统
3、RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1、随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物。
2、oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3、特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR优化
PCR优化主要有：
1、引物的浓度
2、建议使用SYBRGreenI和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的Q