蛋白检测篇1-Western Blot.docx

编号：１－１主题：WesternBlot（蛋白质印迹法）概述：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。目的：获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。原理：与Southern或Northern杂交方法类似但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳被检测物是蛋白质“探针”是抗体“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上固相载体以非共价键形式吸附蛋白质且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应再与酶或同位素标记的第二抗体起反应经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。步骤：1.提取组织或细胞蛋白；2.测定蛋白质浓度；3.电泳：电泳条件为：恒压100V待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）；4.电转膜仪转膜：转膜条件为：恒流250mA2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；7.收一抗PBST洗膜3次10min/次；8.二抗孵育：室温孵育1h所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。9.洗膜：PBST洗膜2次PBS洗膜一次10min/次。10.显色流程图：