Western Blot 蛋白印迹法 (新手).doc

WesternBlot蛋白印迹法－－详细中文操作指南（新手适用）
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，
试剂配制：
（一）母液
1.0mol/LTris·HCl
Tris(MW121.14)30.29g
蒸馏水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PHHCl
7.4约17ml
7.5约16m
7.6约15ml
8.0约10ml
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
PMSF0.174g
异丙醇100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/LNaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98）12g
蒸馏水至500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW358.14）71.6g
蒸馏水至1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDS
SDS10g
蒸馏水至100ml
50℃水浴溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺0.1g
超纯水1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）
Tris(MW121.14)45.43g
超纯水200ml
溶解后，浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温保存。
0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）
Tris(MW121.14)15.14g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温保存。
40％Acr/Bic（37.5：1）
丙稀酰胺（Acr）37.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g
超纯水至100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
Tween2020ml
蒸馏水至100ml
混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（50mmol/LTris·HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100μg/mlPMSF）：
1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5ml
NaCl0.438g
TritonX－1000.5ml
蒸馏水至50ml
混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。
0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）
0.2mol/LNaH2PO419ml
0.2mol/LNa2HPO481ml
NaCl17g
蒸馏水至2000ml
G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250：100mg
95％乙醇：50ml
磷酸：100ml
蒸馏水至1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15mol/LNaCl
NaCl（MW58.44）0.877g
蒸馏水至100ml
高温灭菌后，室温保存。
100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）
BSA0.1g
0.15mol/LNaCl1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。
10％分离胶和4％浓缩胶
10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水4.85ml3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1）2.5ml0.5ml
1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－
0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26ml
10％SDS100μl50μl
10%AP（过硫酸胺）50μl