不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响.docx

中国人民解放军第三0二医院王海滨
写在课前的话
荧光定量PCR质量一般有三个要素,分别是试剂、仪器和人员,另外还有内标的影响。对荧光定量PCR的影响因素较多,因此要得出比较准确、稳定性的PCR结果,需要对各个环节进行严格控制。
荧光定量PCR质量的影响因素有哪些？一、荧光定量PCR质量的三个要素
荧光定量PCR质量一般有三个要素，分别是试剂、仪器和人员。试剂是由生产厂家专门提供，包括核酸提取与扩增两个部分。核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作，扩增部分是由厂家专门制备好的。仪器包括三个方面：温控、光学和软件，不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同，对检测结果也有明显的影响。另外还有内标的影响。
荧光定量PCR质量的影响因素有（）
窗体顶端
A.试剂
B.仪器和人员
C.内标
D.以上均有
窗体底端
A.试剂B.仪器和人员C.内标D.以上均有正确答案：D
解析：荧光定量PCR质量的影响因素有试剂、仪器和人员和内标。试剂包括核酸提取与扩增两个部分，核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作，涉及环节较多。不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同，对检测结果也有明显的影响。
不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响？二、不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果的影响
目前临床常用的核酸提取方法有：一是聚乙二醇法，也称煮沸法；二是层析柱法，也称为提纯法；第三是磁珠法，也称吸附法。第四是近年出现的血清或血浆的检测标本直接加入方法。第五是近年罗氏公司引进的COBASTaqMan全自动核酸提取与扩增系统，其提取原理是磁珠法。
(一)聚乙二醇法
1、操作步骤
取100微升配置好的聚乙二醇工作液，需注意目前所用的聚乙二醇一般是20%的聚乙二醇，较黏稠，试剂盒保存温度为-20度，因此在温室要彻底的复溶，溶化呈液状。加样时吸100微升，因为黏稠，一定要过吸、停顿，然后把吸头外多余的聚乙二醇粘掉，再加到相应的操作管中。吸和加均注意停顿，加入到操作管里面的含量应该尽量精确至100微升。由于液体的黏稠，不同的人、不同的操作手法差异特别大。加好100微升的聚乙二醇后加入100微升待测标本，主要包括血清、血浆或其他液体，二者要彻底混匀。第二步是13000转离心，一般用角度离心机离心10分钟，弃掉上清液，尽可能少留残余，并保证不把沉淀物吸掉，沉淀物含有核酸成分。第三步加入碱性裂解液25微升，碱性裂解液往往带有悬浮物，充分混匀。含有核酸的沉淀物往往比较黏稠，加上碱性裂解液通过振荡混匀常常不会把沉淀物振开，而如果通过吹打混匀，又容易把沉淀物带走一部分。此操作环节建议操作人员咨询实际生产厂家，因为试剂盒标准品不通过核酸提取，如果这一步标本的核酸丢失过多，而外标标准又无变化，对结果的影响较大，是振荡混匀或者吹打混匀，要求操作人员和厂家达成共识。最后一步是100度煮沸10分钟，后13000转离心10分钟。取上清液进行PCR检测。
2、优缺点
优点是操作较快速，可部分去除标本中的PCR干扰物质（胆红素、血脂、离子等）。缺点是核酸丢失严重。弃掉的上清液含有大量HBV（50%左右）；碱性裂解液核酸裂解不彻底，与混匀程度密切相关（丢失30%左右）。操作步骤较多,每个环节均存在不同实验室人员和仪器的差异，因此影响因素较多。
（二）层析柱法
1、操作步骤
层析柱方法主要用于RNA的提取，以QIaGen试剂为例做简单的分析。它分为四个步骤：第一步是取560微升已配置好的核酸裂解液，与140微升待检的标本（血清、血浆或其他的液体）混匀，室温静置10分钟。第二步加500微升的无水乙醇混匀，8000转离心1分钟。第三步是层析柱过滤，将加过乙醇的标本加到层析柱，通过8000转离心1分钟，滤掉多余液体，核酸即可在层析柱上吸附，然后用洗涤液A和B洗脱柱上的盐和蛋白质，13000转高速离心2分钟，将层析柱和层析膜上多余的物质离下去，在层析柱的中间加50微升的洗脱液，室温静置10分钟，让它彻底溶在水中，10000转离心3分钟，洗脱液即可进行PCR扩增。
2、注意事项
第一步核酸裂解液含有异硫氰酸胍或盐酸胍，胍盐是裂解核酸的物质，它在低温时容易结晶、凝集，结晶后如果不能彻底溶化，只是取上清液和带液标本提取核酸，容易出现假阴性。通常的做法是在56度的环境让核酸裂解液彻底溶化，以肉眼看不到结晶为标准。另外是在室温静置10分钟，有的试剂盒是在72度放置10分钟。目前的核酸裂解液对病毒的裂解效果非常强，二者混匀之后，标本中的核酸基本上在1到2分钟均能够彻底裂解，放置的时间延长对病毒裂解效果不再有意义，反而对标本中的RNA起到降解作用。因此建议不同的实验室应摸索最佳条件。第三步是过层析柱，滤过后的液