一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114250275A(43)申请公布日2022.03.29(21)申请号202010998850.0(22)申请日2020.09.22(71)申请人武汉艾米森生命科技有限公司地址430000湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道818号医疗器械园B10栋1楼(72)发明人张良禄李婷婷董兰兰(74)专利代理机构深圳紫藤知识产权代理有限公司44570代理人张晓薇(51)Int.Cl.C12Q1/6851(2018.01)权利要求书1页说明书10页序列表2页附图5页(54)发明名称一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法(57)摘要本申请公开了一种荧光定量PCR反应系统、试剂盒及核酸定量检测方法，所述荧光定量PCR反应系统利用核酸内切酶特异性地产生一段Flap序列，所述Flap序列可作为一段核苷酸序列扩增时的引物，而该核苷酸序列上存在多个的发光探针结合区段，因此，当该核苷酸序列扩增时，发光探针被DNA聚合酶切割而产生荧光信号。由于该核苷酸序列上结合有多个发光探针，且Flap序列的数量与待荧光定量PCR检测的目标基因的数量相关，所以所述荧光定量PCR反应系统可实现对目标基因的特异性扩增，且信号强度大大提升，从而提高了对临界样本的检测灵敏度。CN114250275ACN114250275A权利要求书1/1页1.一种荧光定量PCR反应系统，其特征在于，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针、第一核苷酸序列以及模板，所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述模板上具有与所述上游探针相互补结合的第一区段，且所述模板上具有与所述第二核苷酸序列互补结合的第二区段，且所述模板上不具有与所述第三核苷酸序列相结合的区段；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段；所述下游探针与所述模板结合时，所述核酸内切酶可以从所述重叠的碱基处进行切割释放所述第三核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物。3.根据权利要求1或2所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述发光探针为TaqMan探针，且所述发光探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述第一核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。6.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述荧光定量PCR反应系统还包括：缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶以及用于扩增模板的正向引物和逆向引物。7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR反应系统，其特征在于，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的正向引物相同；或者，所述上游探针的核苷酸序列与用于扩增模板的逆向引物相同。8.一种PCR反应试剂盒，其特征在于，包括：核酸内切酶、上游探针、下游探针、发光探针以及第一核苷酸序列，其中，所述上游探针是与PCR反应的模板的第一区段相互补结合的核苷酸序列；所述下游探针包括相连的第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，并且所述第二核苷酸序列与所述模板的第二区段相互补结合，所述第三核苷酸序列不能与所述模板的任何区段相结合；所述第一区段和所述第二区段之间具有一个重叠的碱基；所述第一核苷酸序列以及所述第一核苷酸序列的互补序列中的至少一者上，具有多个所述发光探针的结合区段和至少一个所述第三核苷酸序列的结合区段。9.根据权利要求8所述的PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第三核苷酸序列是用于扩增所述第一核苷酸序列的正向引物，所述核酸内切酶为Flap核酸内切酶1，对应地，所述第三核苷酸序列为Flap序列。10.一种核酸定量检测方法，其特征在于，是采用权利要求1至7任一项中所述的荧光定量PCR反应系统进行荧光定量PCR检测，或者是采用如权利要求8或9所述的PCR反应试剂盒进行荧光定量PCR检测。2CN114250275A说明书1/10页一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法技术领域[0001]本发明涉及荧光定量PCR技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR反应系统、PCR反应试剂盒及核酸定量检测方法。背景技术[0002]实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)技术是指：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积而达到实时监测整个PCR进程的目的，并