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实验四碱性蛋白酶活力的测定 一、实验原理 以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来,相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂:0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10)、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液(称取5g酪蛋白置于500mL0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10)中,加热使其溶解)、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂,稀释3倍使用 仪器:水浴锅、721分光光度计(含比色皿)、秒表、常规玻璃仪器 三、实验步骤 1、酶液的萃取 称取1g粗酶制剂置于研钵中,加少量缓冲液一起研磨,然后定容至100mL,从容量瓶中取出5mL酶液(视酶活而定)再定容至100mL,稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。 2、酶活力的测定 样品管:取不同量的酶液(0.1~1.0mL:0.2mL、0.4mL、0.6mL),用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10)(对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL)补足体积到1.0mL,然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液,混匀,在40℃准确保温10min,加入2mL5%三氯醋酸溶液,迅速摇匀,于室温静置半小时。 空白管:先在每支试管中各加入1.0mL1%酪蛋白溶液和2.0mL5%三氯醋酸溶液,摇匀后,再加入1.0mL的酶液,酶液浓度分别与对应的样品管相同,在40℃下准确保温10min,以下操作同样品管。 将酶反应混合物过滤后收集滤液,在1mL滤液中加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1mLFolin试剂,摇匀后在40℃恒温水浴中显色20min,以相应的空白管中的反应液为对照,在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。 3、标准曲线 为了确定酪氨酸与OD值的对应关系,需事先用不同浓度标准酪氨酸溶液与Folin试剂反应显色,测定OD值标准曲线。 不同浓度的标准酪氨酸溶液按下表配置: 管号酪氨酸的浓度 (微g/mL)100微g/mL 酪氨酸溶液(mL数)蒸馏水 (mL数)空白0011100.10.92200.20.83300.30.74400.40.65500.50.56600.60.4向上表配制的不同浓度的酪氨酸溶液中分别加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL,Folin试剂1mL,置于40℃恒温水浴显色20min,在680nm下以空白为对照,测定各样品管溶液的吸光度。 (3)以吸光度(OD)为纵坐标,酪氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线,由直线斜率计算K值。 四、数据记录与处理 1、根据标准曲线计算K值 酪氨酸浓度/[µg/mL]0102030405060吸光度0.0000.0780.1770.2860.3610.4030.533 用Excel拟合得,K=114.7(OD值为1时相当的微克数)。 酶活力计算 酶液加 入量/mL相当于粗 酶制剂/克空白管 OD值样品管 OD值净OD值酶活力/[*104单 位数/克酶制剂]平均酶活力/[*104单位数/克酶制剂]0.20.00010.0000.3610.36116.56 13.480.40.00020.0000.5690.56913.050.60.00030.0000.7090.70910.84酶活力的计算: 酶活力(单位数/克酶制剂)=4/10×K×OD×n 式中:4——反应混合物总体积为4mL; 10——酶反应时间为10min; K——标准曲线中OD值为1时相当的酪氨酸微克数,结果为114.7; n——酶液的稀释倍数 讨论 酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响,因此必须严格控制。 用三氯醋酸终止反应后,过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。 因为Folin试剂对酸性环境比较敏感,容易发生变化,因此在测定时有顺序的规定,需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境,之后再加入Folin试剂,使其能正常发挥作用。