酶学实验四 碱性蛋白酶活力的测定.docx

实验四碱性蛋白酶活力的测定
（赖凌峰李佳佳邓仕彬）

一、原理
以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂
1、0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）
2、5%三氯醋酸
3、1%酪蛋白溶液：
称取5g酪蛋白置于500mL0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解。
4、0.4mol/L碳酸钠溶液
5、100μg/mL酪氨酸溶液
6、Folin试剂，稀释3倍使用
如果自己配制，可按下法：于2000mL磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO2.2H2O）25g，加水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10小时。取下回流冷凝器，加入硫酸锂50g，水50mL和浓溴水（99%）数滴，再煮沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤，制得的试剂应显金黄色，贮于棕色瓶内。
三、步骤
1、酶液的萃取
称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定
样品管：
取不同量的酶液（0.2，0.4，0.6mL），用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀并开始计时，在40℃准确保温10min，加入2mL5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。
空白管：
先在每支试管中各加入1.0mL1%酪蛋白溶液和2.0mL5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1mLFolin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。
3、酪氨酸标准曲线
为了确定酪氨酸与OD值的对应关系，需事先用不同浓度标准酪氨酸溶液与Folin试剂反应显色，测定OD值标准曲线。
（1）不同浓度的标准酪氨酸溶液按下表配制：
管
号酪氨酸的浓度
（μg/mL）100μg/mL
酪氨酸溶液（mL数）蒸馏水
（mL数）空白0011100.10.92200.20.83300.30.74400.40.65500.50.56600.60.4（2）向上表配制的不同浓度的酪氨酸溶液中分别加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，Folin试剂1mL，置于40℃恒温水浴显色20min，在680nm下以空白为对照，测定各样品管溶液的吸光度。
（3）以吸光度（OD）为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，由直线斜率计算K值。
四、数据处理
1、根据标准曲线计算K值
酪氨酸浓度（μg/mL）0102030405060吸光度0.0000.1130.2130.3180.4200.5210.614用Excel拟合得，K=97.33（OD值为1时相当的酪氨酸微克数）。

2、酶活力计算
酶液加入量
（mL）相当于粗酶制剂（g）空白管OD值样品管OD值酶活力
（*104单位数/克酶制剂）平均酶活力
（*104单位数/克酶制剂）0.20.00010.0000.29611.52
9.980.40.00020.0000.5129.970.60.00030.0000.6508.44酶活力单位的定义
在上述实验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个酶活力单位。
酶活力的计算：
酶活力（单位数/克酶制剂）=4/10×K×OD×n
式中4——反应混合物总体积为4mL
10——酶反应时间为10min
K——标准曲线中OD值为1时相当的酪氨酸微克数
n——酶液的稀释倍数
五、讨论
1、酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。
2、用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。
3、因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠形成碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用。
4、粗酶制剂称量和酶反应时间需准确记录数据。
5、各空白管中试剂的加入顺序与对应样品管不同，应注意。