制药分离工程实验指导讲义.docx

四川理工学院

制药分离工程实验指导

第一版

制药工程系编
二○一二年

目录

TOC\o"1-1"\h\z\uHYPERLINK\l"_Toc328818120"实验一细胞SOD的提取和分离 PAGEREF_Toc328818120\h2
HYPERLINK\l"_Toc328818121"实验二大枣中多糖的提取分离 PAGEREF_Toc328818121\h4
HYPERLINK\l"_Toc328818122"实验三有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 PAGEREF_Toc328818122\h7
HYPERLINK\l"_Toc328818123"实验四柱层析法对色素的提取与分离 PAGEREF_Toc328818123\h9
HYPERLINK\l"_Toc328818124"实验五质粒的提取及电泳分离 PAGEREF_Toc328818124\h11
HYPERLINK\l"_Toc328818125"实验六八角茴香油的提取与检识 PAGEREF_Toc328818125\h13
HYPERLINK\l"_Toc328818126"实验七秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定 PAGEREF_Toc328818126\h16
HYPERLINK\l"_Toc328818127"实验八大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷 PAGEREF_Toc328818127\h18
HYPERLINK\l"_Toc328818128"实验九重结晶及过滤 PAGEREF_Toc328818128\h20
HYPERLINK\l"_Toc328818129"实验十简单蒸馏及分馏 PAGEREF_Toc328818129\h23
实验一细胞SOD的提取和分离

一、实验目的
1．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。
2．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。

三、试剂与仪器
1.试剂与材料
新鲜蒜瓣、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5、丙酮：用前需预冷至4-10℃、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液、2mmol/L肾上腺素溶液
2.仪器
恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒

四、实验步骤
1.组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2.SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3.除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4.SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。
5.SOD活力测定
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.5肾上腺素溶液肾上腺素溶液蒸馏水0.50.5-样品液--0.5混合均匀，在30℃水浴中预热5min肾上腺素溶液0.50.5
加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：
酶活力（单位）=2（A-B）N/A
式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。
五、实验结果
根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。
六、注意事项
1.酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。
2.肾