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死亡受体5诱导Jurkat细胞凋亡的作用
【摘要】目的：探讨DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用.方法：用含人全长DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB/c小鼠，制备抗DR5mAb.将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞和5mg/L抗DR5mAb，采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率.结果：抗DR5mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎被抗DR5mAb完全阻断，阻断率高达%.结论：DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用.【关键词】Jurkat细胞；TRAIL；细胞凋亡；DR5；抗体，单克隆0引言肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体是近几年新发现的TNF超家族成员，TRAIL与其受体结合可以诱导大多数肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响.已经发现，TRAIL有5种受体，即2种死亡受体、2种诱骗受体及可溶性受体OPG(osteoprotegerin).其中只有DR4［1］和或DR5有胞内死亡结构域，诱导细胞凋亡.DR4和DR5在诱导细胞凋亡方面具有相同的作用，但哪一种受体在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡方面更为重要仍不清楚.发展和应用TRAIL不同受体的特异性抗体是分析这两种不同受体所参与的死亡途径的关键.我们用特异性抗DR5mAb阻断DR5的功能，并应用流式细胞仪检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡情况，以探讨DR5在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.1材料和方法材料含有人DR5细胞外结构域全长cDNA的毕赤酵母表达载体菌株由美国宾夕法尼亚大学医学院病理医学实验室陈有海教授馈赠.Jurkat细胞为本室保存细胞株传代培养于含mmol/LL谷氨酰胺、g/L碳酸氢钠、mmol/LHEPES,mmol/L丙酮酸钠、mL/LFBS,1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养基.DMEM/HAT和DMEM/HT选择培养基.TRAIL凋亡检测试剂盒.FACSCalibur型流式细胞仪.方法抗DR5mAb制备及特异性鉴定抗DR5mAb制备参照文献［2］制备抗DR5mAb.抗DR5mAb类型经ELISA法测定mAb的类型分别为IgG1(YM366,YM369)和IgM(YM362,YM363,YM367)，两者均可与sDR5结合，经流式细胞仪分析发现仅IgG能与Jurkat细胞表面的DR5结合.流式细胞仪分析mAb与胞膜DR5结合取生长状态良好的Jurkat细胞，用含50g/LBSA的PBS洗涤3次，计数细胞，取1×105细胞与杂交瘤细胞培养上清100μL混合，冰浴反应30min.预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1μLFITC标记的山羊抗小鼠IgG或IgM，冰浴30min.预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析.对mAb膜结合的阻断作用将10μLsDR5(178mg/L)与100μL杂交瘤培养上清室温反应30min，然后与1×105Jurkat细胞混合，冰浴反应30min.预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1μLFITC标记的山羊抗小鼠IgG，冰浴30min.预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析.细胞表面DR5表达水平检测将生长状态良好的Jurkat细胞用含50g/LBSAPBS洗涤3次，计数细胞，取密度为1×108/L的细胞100μL，加抗DR5mAb1μg，冰浴反应30min.预冷PBS洗涤细胞3次，加PBS100μL和FITC标记的羊抗小鼠IgG1μL混合，置冰浴30min.PBS洗涤3次后用流式细胞仪进行分析.诱导细胞凋亡率的检测TRAIL凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率，50μL培养基加至96孔U型细胞培养板，第1孔加50μLTRAIL,终浓度为100μg/L，并做倍比稀释.每孔加50μL小鼠抗TRAILmAbIgG1至终浓度为mg/L,加待测细胞悬液100μL,细胞终浓度为1×109/L.37℃,50mL/LCO2培养12h,PBS洗涤3次，每管加PBS100μL,PI10μL,流式细胞仪检测细胞凋亡率.mAb对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞及5mg/L抗DR5mAb，室温反应30min,按方法检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡率.2结果mAb与胞膜表面DR5结合特异性检测mAb与胞膜表面DR5结合率经ELISA分析融合出的5株杂交瘤细胞所有产生的抗DR5mAb均能与sDR5结合，mAb类型影响与胞膜受体的结合，只有抗DR5IgG类抗体(YM366,YM369)能够结合至Jurkat细胞表面.IgM类抗体(YM362,YM363,YM367)无法与细胞膜结合.6A5是不产生DR5mAb杂交瘤培养上清.对mAb阻断作用在无sDR5条件