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熊果酸诱导Jurkat细胞凋亡及其作用机制的研究
摘要：
本研究旨在探究熊果酸对人T淋巴细胞Jurkat细胞的凋亡诱导效应及作用机制。结果显示，熊果酸能够显著诱导Jurkat细胞凋亡，并通过下调B-celllymphoma/leukemia-2(Bcl-2)、抑制下游分子p-Akt等机制实现凋亡诱导作用。本研究对开发新型抗肿瘤药物具有重要的指导作用。
关键词：熊果酸；Jurkat细胞；凋亡诱导；机制
一、引言
熊果酸是一种萘醌衍生物，从中国中草药熊果中提取而来。早期研究发现，熊果酸具有多种药理活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌等。随着生物技术的发展，研究显示熊果酸能够诱导肿瘤细胞凋亡，已成为研究的热点。（殷健，2015）
人体T淋巴细胞Jurkat细胞是一种常用的恶性肿瘤模型细胞，可作为研究抗肿瘤药物的分子靶点。（李嘉明，2011）近年来研究发现，熊果酸能够诱导Jurkat细胞凋亡，但其具体的作用机制仍不清楚。因此，本研究旨在探究熊果酸对Jurkat细胞凋亡诱导作用的机制。
二、材料和方法
2.1材料
熊果酸（purity>98%）（Sigma-Aldrich，美国），DMEM培养基（HyClone，美国），烟酰胺（Solarbio，中国），0.25%胰酶（Gibco，美国），FBS（Gibco，美国），脂质体（Invitrogen，美国），Bcl-2抗体、Caspase-3抗体（Abcam，英国），p-Akt抗体（CellSignalingTechnologies，美国），SPF级nude小鼠。
2.2方法
2.2.1Jurkat细胞的培养
将Jurkat细胞株放入含10%FBS的DMEM培养基中，设置37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24h。将培养液与胰酶（0.25%）混合并放入无菌离心管中，放入37℃孵化箱中孵化5min，离心3000rpm，将上清移去，并加入10%FBS的DMEM培养基中转移至新的无菌离心管中，进行传代。
2.2.2MTT法测定细胞增殖率
将Jurkat细胞种植于96孔板内，加入熊果酸不同浓度（0、5、10、20μmol/L）的DMEM培养液，共孵育24h、48h、72h。取出后加入0.5mg/mLMTT液，孵育4h后吸取培养液。将板内自行制备的离心机中高速离心2min，取上清，再加入150μLDMSO，振荡10min后测定OD值。
2.2.3AnnexinV/PI染色法检测细胞凋亡率
取Jurkat细胞，加入熊果酸不同浓度（0、5、10、20μmol/L）的培养液，共孵育48h。将细胞离心5min，吸去上清液，加入500μLPBS，离心2min，重复以上操作2次后，加入AnnexinV/FITC和PI双荧光染色液，室温下避光孵育30min，取1mL1%脱脂牛乳液进行细胞背景校正。流式细胞术检测样品。
2.2.4Westernblot分析
将Jurkat细胞加入熊果酸不同浓度的DMEM培养液，共孵育48h。将细胞匀浆，加入化学荷尔蒙80，离心5min，收取其上清，进行蛋白浓度测定。将相同的蛋白样品加入10%SDS-PAGE胶，电泳结束后转移至聚丙烯膜上，加入特异性一抗液，室温下孵育2h后加入特异性二抗液和HRP标记的二抗液。辣根过氧化物酶底物染色，洗涤，显像。
三、结果
3.1熊果酸对Jurkat细胞增殖的影响
MTT法检测熊果酸在不同浓度（0、5、10、20μmol/L）下对Jurkat细胞的增殖影响。结果显示，随着熊果酸浓度的增加，对Jurkat细胞的抑制率也随之增加。当熊果酸浓度为20μmol/L时，其对Jurkat细胞的抑制率最高，且呈现出时间和剂量依赖性（图1）。
图1熊果酸对Jurkat细胞增殖的影响
3.2熊果酸对Jurkat细胞凋亡率的影响
AnnexinV/PI染色法检测熊果酸不同浓度（0、5、10、20μmol/L）对Jurkat细胞的凋亡率。结果显示，随着熊果酸浓度的增加，Jurkat细胞凋亡率也随之增加，并呈现出浓度依赖性。当熊果酸浓度为20μmol/L时，其能够显著诱导Jurkat细胞凋亡（图2）。
图2熊果酸对Jurkat细胞凋亡率的影响
3.3熊果酸下调Bcl-2和抑制p-Akt的表达
Westernblot分析表明，与对照组相比，熊果酸处理组中Jurkat细胞中Bcl-2的表达水平下调，Caspase-3的表达水平上调，而p-Akt的表达水平则下调（图3）。
图3熊果酸下调Bcl-2和抑制p-Akt的表达
四、讨论
本研究结果证实了熊果酸能够显著诱导Jurkat细胞凋亡，并且熊果酸对Jurkat细胞凋亡的诱导作用呈现出浓度和时间依赖性。此外，熊果酸还能够通过下调Bcl-2和抑制p-Akt等机制来实现其对Jurkat细胞的凋亡诱导作用。
Bcl-2是一种重要的凋亡抑制基因，其过