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实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用
PCR（PolymeraseChainReaction）技术是一种常用的DNA分析方法。它通过反复的DNA复制和扩增过程，使得DNA序列“复制”成百倍甚至千倍。PCR技术的应用十分广泛，如DNA定性、基因表达检测、病毒检测等。而实时荧光定量PCR技术，是在基础的PCR技术基础上的一种进阶技术，也是现代分子生物学领域中最为常用的高倍增技术之一。
1.实时荧光定量PCR技术的原理：
实时荧光定量PCR技术是在PCR基础上，利用荧光分析DNA扩增的方法。由于PCR技术是一种体外的DNA复制方法，其原理主要是通过DNA的三倍体形态复制和扩增DNA分子。而实时荧光定量PCR技术，主要是通过分析荧光信号的加强与下降，得知PCR反应的基因表达多寡。
在实时荧光定量PCR技术中，需要分别进行PCR反应、检测荧光、以及数据处理等三个步骤。
（1）PCR反应：
PCR反应是实时荧光定量PCR技术中的第一个必要步骤，其原理与普通PCR技术类似。PCR反应主要包括了三个阶段，即：变性、中性、以及延伸。
在变性阶段，PCR反应体系中的DNA双链会被热处理至单链状态，此间在组分中需要添加DNA结合剂以避免双链DNA复合。
在中性阶段，PCR反应体系中的DNA单链会通过特异性的引物序列（或探针序列）与PCR反应体系中的模板DNA（或cDNA）复合，而引物序列是根据需要测定的目标基因不同而设计的不同引物。
在延伸阶段，PCR反应体系中的DNA序列会通过特定的DNA聚合酶将其末端延伸，合成单链DNA。PCR反应过程中，DNA合成过程又会释放出生物荧光，在此间会分析荧光的强弱发生量。
（2）检测荧光：
实时荧光定量PCR技术在检测荧光时，主要是通过对PCR反应所产生的荧光信号的近实时检测。荧光信号的检测主要需要依靠于透过荧光染色剂或特定的引物及探针，将PCR反应的荧光信号另行检测并对其强弱进行定量，以确定扩增基因的表达水平。（通常选用荧光染色剂SYBRGreen进行检测）
（3）数据处理：
PCR反应过程中，由PCR仪器实时监测荧光信号的强度和强度变化，同时将其定量化，并根据PCR反应体系中的标准样品，以及PCR反应的阈值范围，计算基因表达倍数，确定样品中的相关基因表达，以明确DNA扩增情况，以检测基因组DNA、检测和监测变异等。
2.实时荧光定量PCR技术的应用：
实时荧光定量PCR技术也被广泛应用于各种生物学实验室中，主要应用：
（1）基因表达分析：实时荧光定量PCR技术可定量测定基因的表达量，通过该技术可以明确单个基因在不同样本和不同时期下的表达状况，以研究因酶、抑制剂、基因家族、培育条件等对基因表达的影响，以了解基因的功能和生物学性质；
（2）检测和鉴定病原体：实时荧光定量PCR技术可对病原体进行精准的检测和鉴定，因其具有高灵敏度和特异性而被广泛应用于医学检测、农业检测、环境水质检测等领域；
（3）检测突变：实时荧光定量PCR技术可快速、精确地检测及鉴定细胞或个体在基因突变中的状况，以发现病人体内基因的突变，为治疗疾病选择合适的药物提供了一种有效的手段；
（4）遗传性疾病诊断：实时荧光定量PCR技术可在早期诊断遗传性孕产妇及相关胎儿的染色体异常，以及其他遗传性疾病，提高诊断率及疾病治疗效果等。
总之，实时荧光定量PCR技术的出现，大大地扩展了PCR技术的应用前景，使得PCR技术在生物医学研究和生产领域中有了更为广阔的发展前景。