大鼠背根节细胞原代培养.docx

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大鼠背根节细胞原代培养
⒈16mm2盖玻片置于70%酒精中浸泡2h，之后用擦镜纸擦拭干净，晾干，锡箔包裹，高温高压蒸汽灭菌20min；
⒉将1/200多聚赖氨酸（30-35µl）滴于盖玻片中央，不能超过盖玻片边缘，盖玻片置于小培养皿内，小培养皿再置于大培养皿内，大培养皿放置在水盒内，于CO2培养箱内孵育12h；
（1/200多聚赖氨酸的配制：300µl水中加入1.5µl多聚赖氨酸，
水盒内需保持足够的湿度，即在盒盖上可以看到明显大水珠）
⒊所有解剖器械浸泡在70%（或75%）酒精中，刀片于实验开始前半小时浸泡于酒精内
所有实验用具（吸头<灭菌>、培养皿、离心管、试管架、移液枪、解剖镜等）及超净工作台喷洒70%酒精，并于紫外灯下照射消毒；
⒋配制20mlOF培养基（用前取适量<2-3ml>分别放置在2个一次性小培养皿内），取适量4°C预冷的PBS于2个一次性小培养皿（漂洗脊柱）和1支30ml离心管内（稀释器械上的消毒酒精）；
（20mlOF：18mloptimum<基础培养基>+2ml10%FCS）
⒌将约3周龄大鼠置于75%酒精内，消毒并溺死，从尾根处剪开皮毛，取脊柱（尾根至颈下）；
⒍所取脊柱放于PBS（室温）内清洗，第一次漂洗修剪脊柱上多余的肌肉，第二次漂洗纵行剪开椎管，取出椎孔内的背根节，并放置在含有OF的培养皿内；
（背根节在脊髓两侧的椎孔内，取时，应小心、一点点剥离脊髓）
⒎用镊子压住背根节一侧，用刀修剪背根节，切除轴突，并将被膜撕去，余下的膨大部分移入另一含有OF的培养皿内；
⒏用无针头的2ml注射器吸取背根节膨大部分，放置于15ml离心管底部，留取约300µl培养液，再加入500µlOF和4µl胶原酶（5U/ml，100×），轻弹混匀后，置于CO2培养箱内孵育40min；
（也可先全部去除离心管内的OF，再加入800µlOF和4µl胶原酶，胶原酶的用量可根据配制时间的长短而酌情增减
离心管在培养箱内室，可将管盖稍稍拧松一点，取出时，记得拧紧管盖！）
⒐孵育的同时，取出盖玻片，吸去其上的多聚赖氨酸，加入30-35µl1/200层粘连蛋白；
（多聚赖氨酸、层粘连蛋白有增强粘附的作用）
⒑去除离心管内的液体，再一次加入500µlOF和4µl胶原酶，CO2培养箱内孵育40min，期间可轻微摇晃数下；
⒒吸尽离心管内的液体，用PBS清洗3次（每次1mlPBS），动作轻柔，不要打散细胞，尽量完全去除PBS后，再用胰酶清洗1次；
⒓加入500µl0.25%胰酶（450µlPBS+50µl2.5%胰酶），置于CO2培养箱内孵育30min；
（加入胰酶后，可稍稍吹打）
⒔轻轻尽量吸出胰酶液体，加入少量OF进行中和，然后将OF吸出；
（OF的用量没有严格的规定，可多可少，一般50µl，中和的时间大约1min，OF能很快中和胰酶的作用）
⒕加入300µlOF和5µlDNase，轻轻吹打，尽量减少气泡的产生，吹打至离心管内无明显团状或棉条状物，液体呈淡乳白色混浊液；
⒖于1支新的15ml离心管中加入3ml12%BSA，并将上述细胞悬液轻轻地、一滴一滴地加于BSA液体表面，1100rpm水平离心10min；
（BSA的作用：分层，可使细胞沉于管底，而细胞碎片等杂质悬浮于BSA中
细胞悬液加于BSA表面后，会稍稍下沉，但迅速上浮至BSA液面上）
⒗尽量吸去BSA，再加入OF，700rpm有角度离心1min；
（OF的用量不定，1ml左右，目的是为了去除BSA）
⒘轻轻拿出，尽量吸除液体，再加入OF，轻柔吹打细胞，以形成细胞悬液；
（OF的用量依据细胞沉淀的多少和盖玻片的个数而定，一般每个盖玻片上可滴加30-50µl细胞悬液。形成的细胞悬液先于一旁静置）
⒙去除盖玻片上的层粘连蛋白，用OF清洗2-3次，然后在盖玻片上滴加细胞悬液
（每个盖玻片每次OF用量，大约1滴即可，最后一次清洗后，可不必立即去除OF，待细胞悬液加入之前吸去即可）
⒚将培养皿置于CO2培养箱内孵育1.5-2h，然后沿着每个小培养皿壁，在盖玻片边缘缓慢加入OF培养液，CO2培养箱内孵育过夜
（每个小培养皿内加入2mlOF培养液，加入的过程中，不可用力过猛，以免冲动盖玻片
胶质细胞、神经元细胞在OF培养液内均可生长）
⒛镜下观察背根节细胞是否贴壁生长，若贴壁生长良好，可移去OF培养液，加入仅能促进神经元生长的培养液
培养液成分：NGF（7.5ng/ml）+BDNF（5pg/ml）+胆固醇（1/10000）+B27（50×）+neurobaselA+Glutamax（100×）
各成分用量：NGF（100µg/ml）0.3µl，BDNF（100µg/ml）0.1µl，胆固醇0.5µl，B27100µl，Glutamax50µ