正常大鼠原代心肌细胞培养.doc

正常大鼠原代心肌细胞培养

一、实验试剂
1、培养基：PriCellsMedium+10%FBS+1%P/S+PriCellsSupplement
2、冻存液：PriCellsMedium+20%FBS+10%DMSO
3、洗涤液：1×PBS（pH7.4）+1%P/S
4、染色液：0.4%TrypanBlue
5、消化液：PriCellsIsolationofPrimaryCellKit
6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）

二、实验器械
1、培养皿
2、培养瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科镊
5、200目网筛
6、玻璃滴管
7、烧杯
8、15ml离心管

三、实验流程
取材
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取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次
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剪碎至1mm3+消化液（PriCells）
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37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）
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余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min
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上层悬液加消化终止液（PriCells）
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余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次
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收集所有混悬液过200目网筛
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收集滤液1000RPM/10min
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去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬
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染色计数
四、实验操作
1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。

2、取材：出生1—3天幼鼠。

3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1%P/S的1×PBS（pH7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。

4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。

5、终止消化：按1∶1加入消化终止液，中止酶反应。

6、收集重悬细胞：收集中止后的消化液于离心管中，1000rpm，离心10min，弃去上清，加入培养液重悬，染色计数细胞。

7、培养细胞密度：调整细胞密度以5×105个/ml接种入培养瓶。

8、培养：放置于37℃，5%CO2培养箱中。

五、细胞鉴定

1、显微鉴定：接种后12h细胞形态变为梭形或不规则扁平状，24h后即可看到单个细胞的自发收缩，继而细胞逐渐铺展伸出伪足，形成不规则的星形，到第3～4天，细胞相互接触交织成网，形成细胞单层或细胞簇。

2、免疫组织化学鉴定：利用α-横纹肌肌动蛋白抗原检测。

3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为3×104个/孔，48小时候细胞可以长满，用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。

4、细胞固定：用PBS洗涤细胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空气中自然干燥。

5、特异性抗体：按照说明书稀释比要求稀释抗体，加入抗体，放置4℃孵育过夜。

6、洗涤：1×PBS（pH7.4）洗涤3次×15分钟，晾干。

7、标记性抗体：加入荧光标记抗体，37℃孵育1h。
洗涤：1×PBS（pH7.4）洗涤3次×15分钟，晾干。

8、封片：封片剂封片。

9、镜检：荧光显微镜下观察，可见胞浆呈棕黄色染色，表明细胞对α-横纹肌肌动蛋白的表达呈阳性。

六、注意事项

1、选用出生1-3d的幼鼠。

2、在取出心脏之前给实验鼠进行消毒处理。

3、采用多次消化，直到组织块完全消化，减少消化液对细胞的损伤。

4、由于心肌细胞只占总细胞的25%，在接种心肌细胞之前做差速贴壁，除掉大部分成纤维细胞。

5、初分离获得的心肌细胞在生理浓度的钙离子溶液中易丧失收缩活性,为了保持心肌细胞的收缩功能,在分离的过程中应采用4℃的无钙离子Hanks＇缓冲液浸泡和冲洗心肌组织。

七、PriCells细胞图片