大鼠原代肝细胞分离和培养protocol.doc

大鼠原代肝细胞分离和培养
张丽娜2008年4月
原代肝细胞分离和培养试剂
（1）无钙灌流液
NaCl8.3g
KCl0.5g
HEPES2.4g
EDTA0.015g
青霉素105U
链霉素0.1g共2ml

用适量超纯H2O溶解，1mol·L-1NaOH或1mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1L。
（2）胶原酶溶液
NaCl8.0g
KCl0.4g
CaCl20.56g
Na2HPO4·12H2O0.134g
KH2PO40.06g
NaHCO30.35g
葡萄糖1.00g
HEPES5.96g
用适量超纯ddH2O溶解，1mol·L-1NaOH或1mol·L-1HCl调节pH至7.5-7.6，加超纯H2O定容至1L
每次酶灌流液用量25mL，临用前加入IV型胶原酶12.5mg。
（3）HBSS缓冲液
NaCl8.0g
KCl0.4g
CaCl20.14g
MgSO4·7H2O0.2g
Na2HPO4·12H2O0.134g
KH2PO40.06g
NaHCO30.35g
葡萄糖1.00g
HEPES5.96g
用适量ddH2O溶解，1mol·L-1NaOH或1mol·L-1HCl调节pH至7.4，加超纯H2O定容至1L。
以上溶液均过滤灭菌。
肝细胞的消化分散
采用两步法：先用无钙灌流液作预灌流，目的在于冲去残积血，除去或减少肝细胞间的钙离子，以减小细胞间的粘着力。然后再用含钙的胶原酶灌流液灌流，以消化细胞间质而分散肝细胞，具体步骤如下：
预灌流：
健康SD大鼠（体重150～200g），禁食8h后，水合氯醛（10%）麻醉，四肢伸展腹部向上背部固定于操作台上，胸腹部酒精消毒。小心打开腹腔，暴露分离肝门静脉，用留置针门静脉插管，动脉夹立即夹紧，剪断下腔静脉以37℃无钙灌流液以流速20mL·min-1开放灌流，并迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出。先做在位灌流数分钟，此时肝脏及其血管解剖位置保持正常，可保证灌流顺畅。然后，边灌流边剪断肝脏与周围组织的联系，将肝脏移置肝脏托盘内继续灌流；注意不要损伤肝包膜，并尽量保持肝叶和血管的正常位置，不可扭曲。灌流过程中肝脏渐渐变为灰黄色，灌流时间大约10min。预灌流一般需用灌流液约为300mL左右。
②酶灌流：
预灌流后换用37℃的通O2的胶原酶灌流液继续灌流。灌流速度仍维持20mL·min-1。如果灌流通畅，则肝脏颜色均匀。由于肝细胞间质被消化，灌流液进入细胞间隙，因而可见到肝脏逐渐肿胀。可根据经验，肉眼观察肝脏肿胀程度来选择最佳灌流时间，一般酶灌流约需8～15min。
③分散肝细胞：
以下操作在超净工作台内进行。在酶灌流达到最佳效果时取下肝脏，将之移至盛有20mLHBSS缓冲液（含10%胎牛血清）的平皿中。用眼科镊子小心撕去肝包膜，将肝脏在培养液中轻轻振摇，使消化好的肝细胞散落到缓冲液中。操作中要注意尽量轻柔，避免细胞受机械力伤害。过200目不锈钢网筛，滤去剩余的杂组织，形成肝细胞悬液。
肝实质细胞的纯化：
将肝细胞悬液收集,悬液在0～6℃条件下以300-500rpm，离心3～5min，弃去上清，用PBS以同上条件清洗、离心1-3次（离心一次细胞活率较高）。末次弃上清后以培养液（低糖+10%血清）重悬，即可得到绝大部分为肝实质细胞的悬液。
细胞产量及成活率的测定
吸去PBS，加入20ml（LG+10%胎牛血清+0.2%PS）用血细胞计数板按血红细胞计数方法求得每mL悬液中的细胞数，再乘以所得肝细胞悬液的总量mL数，即为细胞产量。用0.6％等张台盼兰（trypanblue）溶液与肝细胞悬液以1：1比例混匀，立即在光学显微镜下用血细胞计数板和计算能够排出台盼蓝而不被染色的活细胞的百分率，即为细胞活率。活率至少须在80%以上的细胞才适合实验应用。
细胞培养
将活力在80%以上的肝细胞以5×105个每毫升的密度接种于预先铺有明胶层的孔板上（取一定量滤头过滤（过滤前明胶至于37-50度水浴锅中，不容易堵住）的0.2%明胶浸润培养板底，4℃过夜，移去明胶溶液），培养液为10%胎牛血清的RPMI1640的培养液（LG，加入0.2%血清），37℃，5%CO2的孵育箱内孵育3-4h后，待细胞基本贴壁，更换培养液，其后每24h换液一次，最多可培养3天。
细胞接板密度：96wells80,000/ml160ul培养基
24wells500,000/ml1ml培养基
6wells3000,000/ml3ml培养基

Cellculture,EROD(7-ethoxyresorufindeethylase)andglucoseoutputassays
Chickembryohepatocytes(CEH)wereculturedaspreviouslydescribedHYPERLIN