基因功能分析的基本策略-硕士.ppt

基因功能分析的基本策略后基因组研究焦点：基因功能研究CentralDogmaCentralDogma反向遗传学——ReverseGenetics抑制基因表达

RNA干扰技术
基因敲除技术
基因转染细胞模型
转基因动物模型

将某一基因从动物基因组中剔除
或将外源基因引入动物基因组
产生经过基因工程修饰（改造）的动物
实现在整体和细胞水平认识基因的功能第一节转基因技术transgenictechnology将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中
通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机发生重组
将外源基因插入到受体细胞染色体DNA中

转基因动物模型实验步骤

转基因载体的构建；
将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；
将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内；
对转基因动物进行鉴定。基因转染细胞模型实验步骤脂质体法电击法

在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。显微注射法

将外源DNA在显微操作系统的辅助下，直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。基因枪法

将要转染的DNA吸附到高黏度的金属颗粒上，在加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的。磷酸钙法
将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，使DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；加入贴壁培养的细胞中被吸收，实现转基因。 瞬时转染：
外源DNA不整合到宿主染色体中，可存在多个拷贝，能产生高水平的表达，但通常只持续几天。

稳定转染：
外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。外源DNA整合到染色体中的概率很小，通常需要通过一些选择性标记进行反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。第二节RNA干扰技术RNAInterference(RNAi)siRNA
RNA诱导沉默复合物
RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅发生在与siRNA同源的部分。RISC:RNA-InducedSilencingComplexRNAi机制RNA干扰实验的基本过程提供RNAi在线技术支持的公司（网站）2.将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进行BLAST比较
3.制备siRNAsiRNA制备常用的五种方法：
化学合成
体外转录
长片断dsRNAs经RNaseIII类降解
siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs
PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
化学合成

质量高，高纯度，高成本
适用于已经验证过抑制效率的靶点序列
不适于筛选靶点序列体外转录

成本适中，省时，适用于筛选靶点序列
不适用于长期的研究或者针对某个特定靶点序列的大量研究长片断dsRNA酶解法

dsRNA在体外被RnaseⅢ家族成员切割成siRNA
不需要验证筛选多个靶点序列
不适用于长期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
载体介导的细胞内表达siRNA方法的特点

操作简便，稳定性好
siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究
适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株4.对目标RNA的干扰

转染靶细胞
对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Westernblot在蛋白质水平上进行监测RNAi实例(载体法)：Targetgene：c-myc2、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/3、其它网站载体构建：dsDNA形成：退火载体的酶切和回收连接转化鉴定转染：瓶颈之一含有真核细胞筛选标志含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾RNA干扰的应用基因治疗方面抗器官移植排斥反应——细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断ICAM-1mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。抗病毒——

斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎
把dsRNA转入小鼠的肝细胞，被分解成siRNA后与小鼠体內的丙型肝炎病毒mRNA相结合，使之分解并失去转译蛋白质的功能。

已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验
且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果
利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题：

导入问题：使用高效载体传递siRNA；
给药方式：因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性；
高选择性：如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。第三节基因敲除技术GeneKnock-out通过DNA同源重组