基因功能分析的基本策略.ppt

第一节利用转基因模型研究基因的功能转基因技术概念一、转基因动物转基因动物应用：1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位；
2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能；
3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型；
4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。
二、稳定转染细胞第二节基因敲除技术基因敲除技术的基本过程：③、在目的基因外侧线性化重组载体，并将一个阴性筛选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。
这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性筛选标志基因、阴性筛选标志基因。在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并保留发育的全能性。
3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞进行筛选。
4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后将胚泡植入假孕小鼠子宫中；
5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色体上，可以用Neor基因作探针，通过Southernblot鉴定。
6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠第三节利用基因沉默技术对基因功能进行分析一、反义RNA技术二、RNA干涉技术RNA干涉的机制：dsRNARNA干涉技术的基本过程2、双链干涉RNA的合成；
化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉：
首先，将干涉RNA转染到靶细胞；
其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Westernblot在蛋白质水平上进行监测