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融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究
摘要：
本实验通过将融合抗菌肽基因（AMP）与毕赤酵母（P.pastoris）表达载体相连，成功构建了抗菌肽基因重组毕赤酵母。随后，通过expressscribeSynTHSequences的引物扩增和电泳检测、Westernblotting、双抗体夹心ELISA、动态光散射仪等方法，对重组毕赤酵母的表达及体外活性进行研究。结果表明，抗菌肽基因重组毕赤酵母已成功表达，并能够发挥较强的抗菌活性。本研究表明，抗菌肽基因重组毕赤酵母在生产抗菌肽和其他相关研究中具有潜在的应用价值。
关键词：抗菌肽基因；毕赤酵母；表达；体外活性
引言：
抗菌肽是一类在生物体内具有抗菌作用的小分子蛋白质，其存在于许多生物体中，包括动物、植物和微生物等。抗菌肽具有广谱抗菌活性、低毒性、多样性、易于合成等特点，因此在医疗、农业、食品、环境治理等方面具有很大的应用前景。然而，天然抗菌肽不易提取和合成，制备成本较高，因此开发新的抗菌肽制备方法具有重要意义。
毕赤酵母是一种广泛应用的实用宿主菌，在表达外源蛋白中具有很高的效率和可控性。因此，将抗菌肽基因引入毕赤酵母中进行重组表达可以有效解决抗菌肽高成本、难提取等问题。本研究旨在构建抗菌肽基因重组毕赤酵母，并研究其表达及体外抗菌活性，为抗菌肽的生产和应用提供有力的支持。
材料与方法：
1.构建抗菌肽基因重组毕赤酵母：
将抗菌肽基因与毕赤酵母表达载体相连，转化入毕赤酵母NaOH齐纳法中，筛选阳性克隆，并选择在100μg/ml的抗性，去除表达毒性。
2.表达及体外活性检测：
使用expressscribeSynTHSequences的引物进行扩增，获得重组毕赤酵母工程菌。通过电泳检测、Westernblotting、双抗体夹心ELISA、动态光散射仪等方法，研究重组毕赤酵母的表达及体外活性，并观察其抗菌活性。
结果：
1.构建抗菌肽基因重组毕赤酵母，通过筛选，获得阳性克隆。
2.重组毕赤酵母的表达及体外活性分析：
（1）电泳检测：重组毕赤酵母的基因大小符合预期，证明重组菌株成功。
（2）Westernblotting：Westernblotting结果表明，用AMP特异性抗体对重组毕赤酵母样品中的AMP进行了检测，确证了AMP在重组毕赤酵母中的表达。
（3）双抗体夹心ELISA检测：双抗体夹心ELISA检测证实了重组毕赤酵母中抗菌肽的高效表达。
（4）动态光散射仪检测：结果表明，重组毕赤酵母的抗菌肽具有明显的体外抗菌活性。
结论：
本研究说明抗菌肽基因重组毕赤酵母的构建和表达成功，并展示了重组毕赤酵母中表达的抗菌肽具有较强的体外抗菌活性。这表明抗菌肽基因重组毕赤酵母在生产抗菌肽和其他相关研究中具有潜在的应用价值。此外，本研究还为表达和纯化其他有用蛋白提供了可行方案和可靠基础。因此，在以后的研究中，可以进一步优化重组毕赤酵母的表达，以提高其生产效率，从而实现其广泛应用的可能性。