烟草HD-ZIP Ⅳ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析.docx

烟草HD-ZIPⅣ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析
烟草HD-ZIPⅣ转录因子NtPDF2基因的克隆及表达分析
摘要：本研究克隆了烟草HD-ZIPⅣ转录因子NtPDF2基因，并进行了其表达分析。通过RT-PCR和荧光定量PCR技术，研究了NtPDF2基因在烟草不同组织和不同生长阶段中的表达特征。结果表明，NtPDF2基因在烟草根、叶和花中均有表达，且其表达量在生长阶段和组织间存在差异。
关键词：烟草、HD-ZIPⅣ转录因子、NtPDF2基因、表达分析
1.引言
HD-ZIPⅣ转录因子是一类高度保守的转录因子，其特点是在DNA结合结构域中包含了一个Homeodomain和Leucinezipper结构域。HD-ZIPⅣ转录因子已被证明参与了植物的生长发育过程、抗逆应答等多种生物学过程。在烟草中，HD-ZIPⅣ转录因子NtHB1的发挥了重要作用（Zhangetal,2015）。在本研究中，我们着重研究了烟草HD-ZIPⅣ转录因子家族中的NtPDF2基因。
2.材料和方法
2.1材料
采用法国烟草品种NC89的种子进行实验研究。RNAfast200转录酶和PrimeScriptRTreagentkit用于RNA的逆转录和RT-PCR反应。SYBRGreenI染料和Real-timePCRDetectionSystem用于荧光定量PCR实验。
2.2方法
2.2.1NtPDF2基因克隆
通过核酸序列比对，设计一对NtPDF2基因特异性引物进行PCR扩增，所使用的引物为：5'-ATGAGAACATTAAGCATTTCCC-3'和5'-TTAGGCGATCTCACTCATGCGAG-3'。PCR反应体系和程序为：2×TaqPCRMasterMix（12.5μl）、10μM引物（1μl）、模板DNA（1μl）、DDH2O（10.5μl），PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40循环。最后，将PCR产物进行凝胶电泳，提取目标段DNA进行测序验证。
2.2.2NtPDF2基因表达分析
收集烟草根、茎、叶和花四个组织中的RNA，进行RNA逆转录反应，获取cDNA。通过RT-PCR测定NtPDF2基因在不同组织中的表达水平。PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35循环。同时利用荧光定量PCR技术对NtPDF2基因在不同组织中的表达水平进行定量分析。
3.结果
3.1NtPDF2基因克隆
通过PCR扩增，获得NtPDF2基因的目标片段，分别进行凝胶电泳和测序验证。结果表明，扩增出的长度约为1000bp，其测序结果与烟草中NtPDF2基因的序列高度吻合。
3.2NtPDF2基因表达分析
通过荧光定量PCR技术，研究了NtPDF2基因在烟草根、茎、叶和花中的表达水平。结果表明，NtPDF2基因在四个组织中均有表达，其表达水平存在差异。在烟草根中，NtPDF2基因表达量最高，在叶中表达量最低；在花中，其表达量也较高。
4.讨论和结论
通过本研究对烟草HD-ZIPⅣ转录因子家族中的NtPDF2基因进行了克隆和表达分析，发现NtPDF2基因在烟草根、叶和花中均有表达，且表达量存在差异。这一发现为今后更深入的研究NtPDF2基因的功能奠定了基础。
参考文献：
ZhangG,GuoG,HuX,etal.IdentificationandfunctionalanalysisoftheHD-ZIPgenefamilyintobacco[J].Journalofintegrativeplantbiology,2015,57(2):188-201.