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条锈菌诱导的小麦转录因子TaWRKY基因的克隆及表达分析
摘要：
小麦是我国重要的粮食作物之一，常受到病害的侵袭影响着产量和品质。条锈菌是其中一种重要的病原微生物，它可以导致小麦条锈病。本研究从受条锈菌感染的小麦中克隆了一个TaWRKY基因，进一步对其进行了表达分析，结果表明该基因在小麦与条锈菌的互作中扮演着重要的角色。这项研究提供了新的线索，有助于深入理解小麦与病原微生物互作的分子机制。
关键词：小麦；条锈菌；TaWRKY基因；表达分析。
1.引言
小麦是我国的主要粮食作物之一，约占全国耕地总面积的17%。小麦条锈病是由条锈菌引起的一种病害，严重影响小麦产量和品质。条锈菌入侵小麦细胞后，会导致一系列反应，包括信号传递、基因表达和代谢等方面的改变。转录因子是调节基因表达的关键分子，包括WRKY家族在内的许多转录因子在小麦与病原微生物的互作中发挥着重要作用（Higashietal.，2008；Liuetal.，2010）。
本研究的目的是从受条锈菌感染的小麦中克隆一个TaWRKY基因，并对其进行表达分析，以深入了解小麦与条锈菌的互作分子机制。
2.材料和方法
2.1.实验材料
本实验采用的小麦品种为“中国春”，同时选取与之配套的条锈菌菌株。
2.2.取材
小麦植株在感染后72小时，分别取小麦根、茎和叶取材，分别称为R、S和L。每组样品重复三次。
2.3.RNA提取和cDNA合成
RNA提取采用TRIzol法。cDNA合成采用PrimeScript®RTMasterMix（Takara）根据说明书操作。
2.4.PCR扩增和基因克隆
PCR扩增条件为：95℃预变性30秒，95℃变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟。反应结束后，进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物大小。扩增出目的基因后，进行向TA克隆至载体pMD-18T（Takara），转化DH5α大肠杆菌，进行测序。
2.5.荧光定量PCR
荧光定量PCR采用SYBRGreenMasterMix（Takara）进行，反应体系为20ul，共有三个技术重复。PCR条件如下：反应开始前，95℃预变性30秒，然后95℃变性5秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应结束后，进行75-95℃梯度升温，检测熔解曲线。使用荧光定量PCR分析目的基因与基因表达水平及其差异。
3.结果
3.1.PCR扩增和基因克隆
通过PCR扩增，成功得到一个长度为913bp的目的基因，克隆并序列测定，并参考NCBI和GenBank数据库的信息，发现该基因为TaWRKY2。为了进一步确定该基因的表达水平和功能，在小麦与条锈菌之间的互作中进行表达分析。
3.2.RT-PCR分析
RT-PCR结果显示，TaWRKY2基因在小麦与条锈菌之间的互作中得到了激活，在受到条锈菌侵染后，基因表达水平有所提高。
3.3.荧光定量PCR
使用荧光定量PCR进一步检测了TaWRKY2基因在不同组织中的表达水平。结果表明，该基因在受侵染的小麦中，表达量显著高于未受侵染的小麦组织中。
4.讨论
转录因子WRKY家族是植物免疫系统中的关键分子，可调节植物对病原物的反应。由于岁月变化和地理位置的影响，在不同品种和地区中，WRKY基因家族不同。本研究采用PCR技术从中国春小麦中克隆得到了一个TaWRKY2基因。通过RT-PCR和荧光定量PCR分析发现，TaWRKY2基因在小麦与条锈菌的互作中显著升高，也就表明该基因在小麦对条锈菌的感染反应过程中具有重要作用。这些结果说明小麦叶片与条锈菌的互作导致了基因表达的改变，包括转录水平的提高。
总之，本研究表明TaWRKY2基因在小麦与条锈菌之间的互操作用具有重要作用。这项研究为深入了解小麦与条锈菌的互作提供了一个新的线索。