绪论3酶分离纯化.ppt

六层析分离表4-5层析分离方法一、吸附层析(link)
二、分配层析(link)
三、离子交换层析(link)
四、凝胶层析(link)
五、亲和层析(link)

附：视频动画
1、色谱柱
2、液相色谱一、吸附层析２、洗脱方法吸附层析（续）３、吸附剂与洗脱剂的选择二、分配层析三、离子交换层析1、离子交换剂的处理与装柱；
2、上柱；
3、冼脱和收集；
4、离子交换剂的再生。四、凝胶层析McBain(1928)提出；

Synge与Tiselins（1950）
在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。
此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。

1959年Porath与Flodim
将部分水解的葡聚糖凝胶交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。１、凝胶层析的基本原理Kd：分配系数，Kd小的物质先流出。
Ve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出
液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。
Vo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积
Vi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。凝胶层析的基本原理（续）1、葡聚糖凝胶：以葡聚糖为单体聚合而成的高分子聚合物。商品名为Sephader，从G-10到G-200共有8种型号。
2、琼脂糖凝胶：商品名为Sepharose（瑞典）Bib-gelA（美国）Gelarose（丹麦）。
3、聚丙烯酰胺凝胶：商品名为Bio-gelP。加入的酶液量为凝胶床体积的10%左右，
不超过30%；
冼脱液体积为凝胶床体积的120%左右；
冼脱液与干胶溶涨和装柱平衡用液相同。五、亲和层析机理图有兩大类力量，构成分子之间的专一性吸引力。一是兩个分子之间，其构形有如积木般的互补，会因为范德华力的关系，产生专一性吸引力另一則为两分子之间，因为某些基团间产生了二級鍵，所造成的吸引力。２、亲和层析方法七电泳分离其它因素用途（酶工程领域）发展形式一、纸电泳
二、薄层电泳
三、薄膜电泳(link)
四、凝胶电泳(link)
五、等电聚焦电泳(link)
常用的电泳技术（续）四、凝胶电泳按装置不同分垂直管型盘状和垂直板型片状；

按凝胶组成系统不同分：采用相同浓度的单体和交联剂，相同pH值和浓度的缓冲液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂甲叉双两烯酰胺在催化剂作用下聚合而成；
丙烯酰胺单体浓度对凝胶孔径有显著影响所使用的凝胶由二或三层不同孔径，不同pH的凝胶层组成;
稀释品在电泳定性中浓缩成层后再进入分离胶分离。提高分率能力;
使净电荷不同或净电荷相同但分子大小形状不同的物质分离.凝胶中的丙烯酰胺浓度由上至下形成由低到高的连续梯度，凝胶内部孔径由上至下逐渐减小。
不同分子量的颗粒电泳后停留在与其大小相对应的位置上。适宜用于测定球蛋白等分子的分子量4、SDS-凝胶电泳两种不同形式的电泳故蛋白质电泳迁移率主要取决于其分子量大小,关系可用如下式表示:五、等电聚焦电泳（1）分辩率高（等电点仅差0.01~0.02pH）；
（2）防止扩散；
（3）不管加样部位；
（4）样品稀，重现性好；
（5）测定等电点准确。等电聚集电泳的实现1、两性电解质2、稳定pH梯度形成3、等电聚焦电泳介质4、聚集电泳的操作等电聚焦电泳的应用八萃取分离双水相萃取双水相萃取(续)双水相萃取(续)超临界萃取超临界萃取（续）CO2超临界萃取工艺超临界萃取（续）反胶束萃取反胶束萃取（续）反胶束萃取（续）九酶的结晶（1）酶液中酶的纯度50%以上；多次重结
晶，纯度提高，收率下降。
（2）酶液的浓度，太稀无法结晶，越浓越
容易结晶，太浓，结晶小。
（3）其它因素：温度、pH值、离子强度。盐析结晶法

有机溶剂结晶法

透析平衡结晶

等电点结晶法一、盐析结晶法二、有机溶剂结晶法三、透析平衡结晶法四、等电点结晶法十浓缩与干燥