酶的分离纯化.ppt

酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。
针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。
酶的分离纯化又有其自身特点：
难点：目标酶在细胞中含量少
优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪
酶的分离纯化是一门实验科学
酶的分离纯化，就是将酶从细胞或者其他含酶的原料中释放出来，再与杂质分开，而获得符合研究和使用要求的酶制品的过程细胞结构与酶分布选用技术前，需考虑：不同酶的分离、提纯方法，主要根据：酶的提取、分离纯化技术路线酶的分离纯化可以分为三个阶段主要过程：
细胞破碎酶的提取离心分离过滤沉淀层析电泳萃取浓缩干燥结晶保存。。。
一、酶分子制备的前处理材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，且动物材料则需深度冷冻保存：
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。
微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
2、细胞的破碎机械破碎机械法（注意预冷）：物理法：化学与生物化学方法
动物细菌植物
∣研磨∣超声波∣纤维素酶∣匀浆∣溶菌酶∣↓捣碎机↓化学溶剂(甲苯)↓

提取液3.生物大分子的提取（抽提）提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。⑴盐溶液提取：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。(2)稀酸（碱）溶液提取(3)变性剂的使用典型的抽提液组成（4）有机溶剂提取酶的主要提取方法二、酶分离纯化的基本技术（简介）(一)沉淀——根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而分离+酶分子制备中最常用的几种沉淀方法中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。中性盐的选择②分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L的(NH4)2SO4保存可达数年之久。
④可以分级沉淀:半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
⑤价格便宜，废液不污染环境。影响盐析的因素

盐饱和度的影响
不同的蛋白质，所需的饱和度不同
蛋白质浓度的影响
在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀
蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜pH的影响但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pI附近
温度的影响在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。注意事项：2、有机溶剂沉淀有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。基本原理优点：
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。
缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。3、选择性变性沉淀法4、等电点沉淀法氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质
由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想
因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。

5、有机聚合物沉淀法优点：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。
③沉淀后有机聚合物容易去除。（二）透析（三）过滤过滤的分类及其特性
(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)四种常用膜分离过程的截留特性超滤优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶