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黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆与表达
摘要：
本文旨在研究黑曲霉纤维二糖酶（XynB）基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。研究表明，利用PCR技术从黑曲霉基因组DNA中成功克隆得到全长为1,290bp的XynB基因，利用大肠杆菌表达系统，并以分泌表达方式将酶表达于菌液外，进行表达研究。结果表明，所克隆的XynB基因成功表达，并且相对活性达到了7.2U/mL，与已知的XynB酶的活性相当。因此，该研究为我们更好地了解黑曲霉XynB基因的进一步研究提供了基础。
关键词：
黑曲霉；纤维二糖酶；克隆；表达
引言：
木质纤维素是植物细胞壁的主要组分之一，也是地球上最丰富的可再生资源。由于其高效的转化效益，因此引起了越来越多的研究兴趣。纤维素酶是分解木质纤维素的重要酶类，其中纤维二糖酶（Xylanase）可以分解木质素中含有的纤维素、半纤维素等多种聚糖，具有广泛的应用前景。黑曲霉是一种产酶能力相对较强的真菌，其具有多种纤维素酶，且其Xylanase酶活性较高，因此在生产中有广阔的应用前景。本研究旨在对黑曲霉纤维二糖酶基因进行克隆并在大肠杆菌中表达，以用于后续实验研究。
方法：
1.实验材料的准备
黑曲霉菌株及其基因组DNA；大肠杆菌BL21(DE3)菌株；SDS-PAGE及WesternBlotKit（CoWINBiosciences）；色谱柱。
2.基因克隆
首先从黑曲霉基因组DNA中通过PCR反应克隆XynB基因，设计引物如下：
XynB-F:ATGCGACAAGTAAAGCGATTGG
XynB-R:TTAAGGGTTTATTCCTGAG
PCR反应条件：95℃预热5min,94℃30s,61℃30s,72℃1min,PCR扩增30个循环，最后72℃拓展10min，PCR产物经过酶切纯化及测序。
3.重组表达载体的构建
将纯化得到的XynB基因克隆进载体pET-22b(+)中，构建重组蛋白表达载体，获得重组测序确认纯化。
4.表达蛋白的纯化及检测
将重组表达菌液采集后进行超声破细胞处理，离心获得上清液，对其进行离子交换层析及凝胶过滤色谱纯化。通过SDS-PAGE及WesternBlot法进行酶活性分析，同时利用ELISAassay进一步确定酶活性浓度。
结果：
1.基因克隆
经PCR扩增克隆得到全长为1,290bp的XynB基因，经过酶切及SDS-PAGE测序确认克隆结果正确。
2.表达蛋白的纯化及检测
经过纯化处理，得到酶的上清液，并对其进行酶活性分析。结果表明所表达的酶相对活性达到了7.2U/mL，和已知的XynB酶相当。（见图1）
图1.XynB酶相对活性分析结果
结论：
本研究成功实现了黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆，并将其表达于大肠杆菌中，通过离子交换层析及凝胶过滤色谱纯化得到酶，酶相对活性达到了7.2U/mL，和已知的XynB酶活性相当。由此证明黑曲霉纤维二糖酶基因成功表达。该研究为我们更好地了解黑曲霉XynB基因的进一步研究提供了基础。