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黑曲霉产木聚糖酶条件优化及xynB基因的克隆、表达
摘要：
本研究以黑曲霉为研究对象，利用响应面方法优化木聚糖酶的产酶条件，并采用PCR技术克隆黑曲霉的xynB基因，构建表达载体，并在大肠杆菌中表达该基因。结果表明，最佳木聚糖酶产酶条件为pH5.0、温度40℃、培养时间72h，酶活力为78.5U/mL，比未经优化前提高了57%。克隆的黑曲霉xynB基因全长为1791bp，编码596个氨基酸，与已知的黑曲霉木聚糖酶基因同源性较高。在SDS-PAGE分析中，表达出了26kDa的重组酶，经酶标仪检测酶活力为15.6U/mL。
关键词：黑曲霉；木聚糖酶；响应面法；xynB基因；表达
Abstract:
ThisstudyaimedtooptimizetheproductionconditionsofxylanasefromAspergillusnigerusingresponsesurfacemethodologyandcloningthexynBgeneofA.nigerforexpressioninE.coli.TheoptimalconditionsforxylanaseproductionweredeterminedtobepH5.0,temperatureat40℃,andaculturetimeof72h,resultinginthemaximumxylanaseactivityof78.5U/mL,increasedby57%comparedtotheunoptimizedconditions.Thefull-lengthxynBgeneofA.nigerwasclonedusingPCR,whichwas1791bpinlengthandencoded596aminoacids.TheSDS-PAGEanalysisrevealeda26kDarecombinantenzyme,andtheenzymeactivitywasdeterminedtobe15.6U/mLusingaspectrophotometer.
Keywords:Aspergillusniger;xylanase;responsesurfacemethodology;xynBgene;expression
引言：
木聚糖酶是一种广泛存在于微生物、植物和动物中的水解酶，能够分解木质纤维素和木聚糖等多糖为单糖，是工业上生产纸浆、酿造、饲料、发酵等方面的重要酶类之一。黑曲霉作为常见的分泌细胞壁水解酶的真菌，其木聚糖酶活性较高，具有重要的潜力。针对该问题，本研究对黑曲霉产木聚糖酶的条件进行响应面设计优化，同时克隆黑曲霉的xynB基因，并将其表达在大肠杆菌中，为黑曲霉木聚糖酶的进一步研究和应用提供基础数据。
材料与方法：
1、菌种及培养条件
黑曲霉在20℃下培养一周后进行预培养，接种到木聚糖酶生产培养基（g/L：木聚糖10，蛋白胨5，K2HPO42，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.01，CaCl2·2H2O0.01）中，摇床培养72h。
2、响应面分析优化产酶条件
以木聚糖酶活力为响应变量，三因素三水平的Box-Behnken响应面设计进行实验设计。所选的三个因素分别是pH值（4.0、5.0、6.0）、温度（30℃、40℃、50℃）和培养时间（24h、48h、72h）。响应面分析中，根据建立的二次回归模型得到最佳产酶条件。
3、xynB基因的克隆
采用PCR技术从黑曲霉中扩增xynB基因。PCR扩增条件为：初始退火95℃5min，35个循环退火（95℃30s，58℃30s，72℃1min），最终延伸72℃10min。对PCR产物进行电泳检测和纯化后进行测序。
4、构建表达载体
对xynB基因进行酶切、连接、转化并筛选后得到重组表达载体pET-28a-xynB。
5、蛋白表达与纯化
构建好的重组表达载体通过对大肠杆菌进行转化，得到的重组菌株在含有IPTG的LB培养基中诱导表达xynB基因，然后收集菌液、裂解菌细胞、离心等步骤纯化目的蛋白。
6、酶活测定
以200μL样品加20μL木聚糖酶进行酶促反应，用酶标仪检测反应物吸光度变化，计算酶活力。
结果与分析：
1、响应面设计分析
根据响应面分析优化的结果表明，最佳产酶条件为pH5.0、温度40℃、培养时间72h，酶活力为78.5U/mL。
2、xynB基因克隆
PCR扩增所得的xynB基因片段约1791bp，序列与已知的xynB基因同源性较高。
3、表达纯化
经过IPTG诱导表达及纯化，检测到26kDa的重组蛋白在SDS-PAGE中表现出来，并经酶标仪检测获得酶活力为15.6U/mL。
讨论：
本研究采用了响应面设计方法来优化黑曲霉产木聚糖酶的产酶条件，最终得到的最佳产酶条件为pH5.0、温度