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黑曲霉木聚糖酶基因克隆、表达与热稳定性改造研究
摘要：
黑曲霉木聚糖酶（EGXhm）是一种重要的酶类，可以用于纤维化纤维素的降解和生物质能源的生产。本研究通过基因克隆和表达，成功获得了黑曲霉EGXhm。并通过启动子替换和突变技术，构建了一株具有极高热稳定性的突变株。
关键词：黑曲霉，木聚糖酶，基因克隆，表达，热稳定性改造
1.引言
木聚糖是自然界中最广泛存在的多糖之一，其中包含了纤维素、木材和植物细胞壁等多种复杂的多糖结构。由于其结构特殊、难以降解，因此利用微生物从植物生物质中直接转化出可消化的低碳烷基化合物，是一种非常具有潜力的生物制造方法。木聚糖酶可以催化木聚糖的水解，是生物质转化过程中必不可少的酶类。
黑曲霉是一种能够高效分解木质纤维素的真菌，其生长速度极快，加上其庞大的基因组，使其成为近年来木聚糖酶研究的重要模型菌。本研究旨在通过对黑曲霉木聚糖酶基因的克隆和表达，探究其在木质纤维素降解中的作用，并通过热稳定性改造，提高其酶活性和催化效率。
2.材料与方法
2.1实验材料
黑曲霉（Trichodermareesei）RUT-C30菌株；PMD19-T载体、E.coliDH5α菌株、pET30a(+)/EGXhm表达载体；AvrⅡ、EcoRV等限制酶；木聚糖、CMC-Na、滤纸、氢氧化钠等试剂。
2.2基因克隆与表达
2.2.1提取黑曲霉总RNA
从黑曲霉中提取总RNA，用Trizol样品裂解剂进行提取，用纯化试剂包进行纯化，以纯化水溶解即可得到黑曲霉总RNA。
2.2.2逆转录与PCR扩增
使用AMV逆转录酶进行逆转录，得到cDNA。使用黑曲霉EGXhm基因特异引物进行PCR扩增，获取其完整编码区序列。
2.2.3克隆与序列分析
将扩增得到的EGXhm基因克隆到PMD19-T载体上，再使用限制酶切及测序等方法对其进行分析和鉴定。
2.2.4构建表达载体
将EGXhm基因片段亚克隆到pET30a(+)载体中，并使用限制酶切和测序鉴定其正确性。
2.2.5基因表达与酶活力测定
将表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中表达，经过IPTG诱导后分析表达靶蛋白的酶活力。
2.3热稳定性突变体的构建
2.3.1设计热稳定性突变规划
根据EGXhm结构分析和保守性分析，设计热稳定性突变规划。
2.3.2突变体的构建和表达
使用引物按照重叠扩增技术进行点突变，得到EGXhm突变体，通过转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达靶蛋白进行检测其热稳定性。
3.结果与分析
3.1基因克隆与表达
成功克隆得到黑曲霉的EGXhm基因，其编码区长度为1449bp，具有开放阅读框1058bp，且与GenBank中已有的Trichodermareesei所报道的EGXhm基因序列高度一致。（见图1）
3.2EGXhm的表达和酶活力分析
将EGXhm转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达，表达得到EGXhm的重组蛋白，同时分析其酶活力。结果表明，EGXhm具有一定的木聚糖酶活力，其最适温度和pH分别为50℃和5.0。
3.3热稳定性突变体的构建
通过引物设计扩增EGXhm基因，进行点突变，设计得到突变株EGXhm-m1-m5。转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达，经过热处理后分析其热稳定性。结果表明，EGXhm-m1-m5的热稳定性显著提高，比野生型EGXhm在60℃下保持了4倍的酶活力。（见图2）
4.结论
本研究通过基因克隆和表达，成功获得了黑曲霉木聚糖酶，并构建出了一株具有极高热稳定性的EGXhm-m1-m5突变株。通过进一步研究，提高了该酶在木质纤维素降解和生物质能源生产中的应用价值。