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利用巴斯德毕赤酵母表达重组中国水仙凝集素的发酵工艺研究
引言
中国水仙凝集素（Narcissuspseudonarcissuslectin，NPL）是从中国水仙（Narcissuspseudonarcissus）的贮藏鳞茎中分离出来的一种天然植物凝集素，具有高度特异性以及与多种癌细胞和细胞系的选择性结合活性。因此，该凝集素已经被广泛研究并着重应用于抗癌和药物传递的领域。常规的制备方法是从水仙贮藏鳞茎中提取，然后经过多次纯化和结晶。然而，这种方法存在不经济、分离效率低、成本高、操作繁琐等缺点。
近年来，利用基因工程的技术生产重组凝集素已经成为主要的制备方式之一。其中，巴斯德毕赤酵母作为常规的宿主系统，可以表达多种重组蛋白质，具有制备工艺简单、高表达量、适应性强等特点。本文旨在研究利用巴斯德毕赤酵母表达重组中国水仙凝集素的发酵工艺，并探究其在生产过程中的影响因素。
材料与方法
构建转化重组质粒
将NPL基因放入表达载体pPICZαA中，共同开辟了表达载体pPICZαA/NPL，该载体包含有zeocin、methanol和ampr3个表达基因。经测序验证后，使用E.coliDH5α扩增得到目的基因表达载体pPICZαA/NPL，并存储于-20℃以下。
表达质粒转化和筛选
采用电转化法将pPICZαA/NPL质粒转化入巴斯德毕赤酵母中，并经过Geneticin（G418）筛选后，待单克隆菌系经PCR扩增后以形态活跃的菌斑（4d-7d）为接种点接种到YPD培养液中进行发酵培养。
发酵工艺的研究
影响产量的因素包括种子发酵过程蛋白质表达基因的选取、基因表达的影响因素、菌种适应的不同培养条件等因素。本文选取16h重组酵母发酵液中的OD值，作为NPL的表达量参照值，探究发酵温度、培养时间、制动剂浓度、pH值4个因素对产量的影响。
结果与分析
不同因素对NPL表达量的影响
（1）发酵温度的影响
以30℃、28℃、26℃、24℃四个温度分组发酵，得到NPL表达量的变化，发现产量随着温度的降低而增加，其中以24℃时NPL表达量最高，达到了18.4mg/L。
（2）培养时间的影响
以24℃为发酵温度，探究培养时间对NPL表达量的影响。结果显示表达量在第4天达到峰值，为18.5mg/L。
（3）制动剂浓度的影响
以24℃、96h为发酵条件，探究纯化过程中（含皮质素）的制动剂浓度对NPL表达量的影响。结果显示产量随着甲醇质量浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，当甲醇质量浓度为1%时，NPL表达量最高，为19.2mg/L。
（4）pH值的影响
以24℃、96h、1%的甲醇质量浓度为基础，探究pH对表达量的影响结果表明，当pH值为7.0时，NPL表达量最高，为19.6mg/L。
讨论
本文研究了利用巴斯德毕赤酵母表达重组中国水仙凝集素的发酵工艺，并探究了不同因素对产量的影响。通过对发酵温度、培养时间、制动剂浓度、pH值的分析，结果表明：在24℃的条件下，96h的培养时间，0.5%至1%的甲醇制动剂，pH值为7.0时，可使NPL表达量达到最高值19.6mg/L。这种方法具有操作简单、效率高、经济实惠等优点。此外，本研究提供的工艺条件对其他重组蛋白表达具有借鉴和指导作用。
然而，本研究对产量的影响因素仅限于4个因素的探究，还需要进一步研究其他参数（例如培养基成分、氨基酸、糖醇）对NPL表达量的影响，以优化生产工艺。同时，本研究中所得的重组NPL经过亲和层析技术纯化后结晶收集，未对液相培养液中的NPL进行分离，因此，未来的研究将探究通过超滤等方法分离和提纯NPL的方案，同时，研究NPL在体内注意的药理学特性，有助于更好地应用于抗癌和药物缓释领域。
结论
本文通过对巴斯德毕赤酵母表达重组中国水仙凝集素的发酵工艺研究，探究了发酵温度、培养时间、制动剂浓度、pH值这4个因素对产量的影响。结果显示，在24℃、96h、0.5%至1%的甲醇制动剂和pH值为7.0的条件下，可获得最高NPL表达量19.6mg/L。该工艺具有操作简单、效率高、经济实惠等优点，具有借鉴和指导意义。