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基于ORF3基因检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用
引言
猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）是一种高度传染性的猪传染病，其主要症状为肠道病变和腹泻，严重影响了养猪业的健康发展。因此，PEDV的及时、准确的检测方法对于猪肉生产企业的维持与发展具有重要意义。目前，国内外已经建立了多种PEDV检测方法，其中包括PCR、RT-PCR、ELISA和ISCOM等。
本文主要研究基于ORF3基因的PEDV荧光定量RT-PCR方法的建立和应用。ORF3基因编码着PEDV的膜蛋白，作为PEDV的分子标记，被广泛应用于PEDV检测。本研究的目的是通过建立ORF3基因的荧光定量RT-PCR方法，实现对PEDV的快速、敏感、特异性检测，并为PEDV防控提供有效手段。
材料和方法
试验物质
1.PEDV阳性标准品和负性对照品；
2.超纯水；
3.PCR引物和探针。
试验方法
1.RNA提取：采用RNAzol™RTRNA提取试剂盒进行提取。
2.cDNA合成：利用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit进行反转录反应。
3.Primer和探针的设计：设计ORF3基因的引物和探针；对引物和探针进行特异性和灵敏度检测。
4.荧光定量PCR反应体系和条件的优化：对PCR反应体系和条件进行优化。
5.标准曲线的构建：使用10倍稀释PEDV阳性标准品制备6个标准曲线样品，分别为：10^7、10^6、10^5、10^4、10^3、10^2copies/μL。
6.实际样品检测：利用建立的ORF3基因的荧光定量RT-PCR方法，对实际样品进行检测。
结果
1.引物和探针设计：本研究设计了ORF3基因的引物和探针，序列如下。
Forwardprimer：5'-GAAGTGGTGATTTGTACCTGCT-3'；
Reverseprimer：5'-CCAACTTGGTTTAAGCTCCAAT-3'；
Probe：FAM-CAGCACCCACAAGCCACTCCTCC-BHQ1。
2.特异性检测：利用扩增出的目的基因片段进行BLAST检索比对，结果显示该基因片段序列与PEDVORF3基因完全匹配。
3.荧光定量PCR反应体系和条件的优化：经过PCR体系和条件的多次优化，得出如下的反应体系和条件表格。
4.标准曲线的构建：通过PCR扩增得到PEDV阳性标准品，稀释后制备了6个标准曲线样品，如图1所示。
图1PEDV标准曲线图示
5.实际样品检测：对15份猪粪便样品进行检测，结果如图2所示。
图2实际样品检测结果
分析与讨论
本研究建立了基于ORF3基因的PEDV荧光定量RT-PCR方法，并进行了特异性、灵敏度、标准曲线和实际样品检测。结果表明，该方法特异性高、灵敏度好，可用于PEDV的快速、准确、敏感、特异性的检测。
ORF3基因编码着PEDV的膜蛋白，是PEDV的分子标记，因此被广泛应用于PEDV检测。本研究并不是第一个使用ORF3基因进行PEDV检测的研究，但本研究从荧光定量PCR反应体系和条件、标准曲线构建到实际样品检测等多个方面均进行了优化，提高了检测的灵敏度、特异性和可靠性。
总结
本研究成功建立了基于ORF3基因的PEDV荧光定量RT-PCR检测方法，并进行了实际样品检测。该方法具有快速、准确、敏感、特异性等特点，可为PEDV的研究和防控提供有效的手段。同时，本研究也为其他病毒的检测提供了一定的参考价值。