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猪流行性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
摘要：
本研究建立了一种针对猪流行性腹泻病毒（PEDV）的实时荧光定量PCR检测方法，并应用于猪肠道样品的检测。该方法利用SYBRGreen导致的DNA电荷转移效应进行荧光检测，通过引物与模板DNA的特异性结合，在荧光信号依次增加的过程中确定PEDV的存在量。经过实验验证，该方法具有高度灵敏度和特异性，可以快速、准确地检测PEDV的存在量，为PEDV的快速检测提供了有效的工具。
关键词：猪流行性腹泻病毒；实时荧光定量PCR；SYBRGreen；特异性；灵敏度
一、引言
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种致命性的病毒，在全球范围内造成了重大的经济损失。PEDV主要通过口服感染进入肠道，引起严重的腹泻、脱水和死亡。当前，PEDV的快速检测和有效控制已成为猪业发展的重要议题之一。实时荧光定量PCR技术是一种快速、准确、灵敏的检测方法，被广泛应用于动物病原体的检测中。
本研究旨在建立一种针对PEDV的实时荧光定量PCR检测方法，并应用于猪肠道样品中，以期为PEDV的快速检测和有效控制提供支持。
二、材料与方法
2.1样品
本研究选取了15只感染PEDV的猪肠道样品，作为实验样本。
2.2试剂和设备
SYBRGreenI荧光染料、腺苷酸、TaqDNApolymerase、PEDVPCR引物和质控基因β-actinPCR引物、PCR仪、荧光检测仪等实验设备和试剂均采用商用品牌。
2.3实验方法
（1）基因序列设计和合成
根据PEDVN基因的保守区域，设计并合成了2对引物：PEDV-F（5’-AAGGACTGGGTATGGGTCTGA-3’）和PEDV-R（5’-CCACAGATTTTCCGAGTGAATG-3’），质控基因β-actin的引物为β-actin-F（5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’）和β-actin-R（5’-AAGGGTTAGGACGTAGCACAG-3’）。
（2）PCR反应配置和条件
首先进行PEDV基因和质控基因β-actinPCR反应体系的优化，最终PCR反应中PEDVPCR反应体系中，PEDV-F和PEDV-R引物的最优浓度为0.2μmol/L，SYBRGreen的最优浓度为10ng/ml。PCR反应条件为50℃2min，95℃10min，然后进行40个环节的DNA扩增，每个环节的温度分别为95℃15s，60℃60s。
（3）建立PEDV实时荧光定量PCR检测方法
对上述优化后的PEDVPCR反应条件进行调整，确保检测PEDV时引物的特异性和灵敏度。最终PEDV实时荧光定量PCR反应条件为50℃2min，95℃10min，然后进行40个环节的DNA扩增，每个环节温度分别为95℃15s，55℃30s，72℃30s。PCR反应后，需要进行熔解曲线分析，以检测PCR产物的特异性。
（4）检测PEDV肠道样品中的存在量
从15个PEDV感染的猪肠道样品中提取总RNA，并进行cDNA反转录。应用上述PEDV实时荧光定量PCR方法，检测其中PEDV的存在量。
三、结果
3.1PEDV实时荧光定量PCR检测方法的建立
在PEDVPCR反应条件优化的基础上，经过反复尝试，我们确定了PEDV实时荧光定量PCR反应条件。PCR产物的熔解曲线分析结果验证了该方法的特异性和准确性。
3.2PEDV肠道样品中PEDV的检测
针对15个PEDV感染的猪肠道标本，应用上述PEDV实时荧光定量PCR方法进行检测。其中，11个样品检测出PEDV阳性，4个样品未检测出PEDV阳性。
四、讨论
本研究建立了一种针对PEDV的实时荧光定量PCR检测方法，并应用于猪肠道样品中。实验结果表明，该方法具有较高的灵敏度和特异性，可以快速、准确地检测PEDV的存在量，并具有广泛应用前景。
实时荧光定量PCR技术的优势在于其高灵敏度和高特异性，可以快速、准确地检测病毒和疾病。在我们的研究中，通过优化PEDVPCR反应条件，建立了一种准确性高、灵敏度高的PEDV实时荧光定量PCR检测方法。该方法通过SYBRGreenI荧光染料引起的DNA电荷转移效应，能够明确PEDV存在量，具有较高的特异性和灵敏度。
通过对PEDV肠道样品的检测，本研究证明该PEDV实时荧光定量PCR检测方法具有实际的应用价值。该方法可用于PEDV的大规模检测和疫情监测，为猪业的发展提供了有力的保障。