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猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）是一种属于科罗纳病毒科的病毒，能引起猪出现急性腹泻、呕吐、水肿等严重症状，尤其在仔猪群体中造成较大影响。目前，在全球范围内，PEDV的暴发和流行已经给养殖业带来了巨大的经济损失。因此，建立一种高灵敏度、高特异性的PEDV检测方法是非常关键的，有助于及时发现和控制PEDV流行，从而防止其对养殖业的进一步损害。本文旨在介绍一种基于TaqMan荧光定量PCR技术的PEDV检测方法，并对该方法的可行性和优越性进行评价。
1、TaqMan荧光定量PCR技术原理
TaqMan荧光定量PCR技术是一种快速、准确、高效的DNA检测技术，其基本原理是在PCR反应过程中，以或双链DNA的中间部分引物分别称为探针（probe）。探针是一种长度为25~30bp的寡核苷酸，在其两端分别标记有荧光染料，如FAM（荧光素发射染料）和VIC（溴化萘染料），以及探针的中间和引物互补，使探针靠近引物的区域，从而获得高灵敏性、高特异性和准确性的检测结果。在PCR反应中，当探针与特定的目标DNA序列（如PEDV）结合时，由于推针上的荧光染料的发射谱描在此瞬间，因此在PCR过程中引物的扩增过程中，荧光信号随着目标DNA的增加而增强，从而获得该靶标的DNA数量。
2、建立PEDVTaqMan荧光定量PCR方法
2.1、PEDV影响养殖业的原因
PEDV是一种非常容易传播和感染猪只的病毒。其主要途径为直接或间接接触感染源，如病猪肠内容物、粪便、尿液、口液等。此外，通过饮水和食物也能传播病毒。这些途径使得PEDV的传播速度非常快，也更容易在养殖场内流行，从而对养殖业造成较大威胁。
2.2、PEDVTaqMan荧光定量PCR方法的建立
为了检测PEDV的存在，我们需要一种高度灵敏、高度特异的检测方法。由于PEDV的基因组与其他属于科罗纳病毒科的病毒基因组相似，因此选择特定的靶标基因至关重要。PG5和PG6编码的N蛋白是PEDV中一个高度保守的蛋白质，因此可以作为PEDV的特异核酸标识。接下来，我们将其作为引物将TaqMan荧光定量PCR方法用于PEDV检测。下面是该方法的步骤：
（1）提取样品RNA
首先，我们需要从样品中提取RNA，如PEDV病原体处理后的粪便、血清、组织和细胞培养物等，可以使用RNA提取试剂盒进行RNA提取。
（2）RNA逆转录
为了将RNA转化为cDNA，需要进行逆转录实验。反转录分别包括用随机六核苷酸引物和AMV病毒反转录酶对RNA进行逆转录（50度反应30min，70度10min，4度保存），获得模板cDNA。
（3）TaqMan荧光定量PCR反应
获得cDNA后，使用PG5和PG6作为引物(Table1)参与进行PCR扩增反应。TaqMan探针的序列为5'（ATTTGACCAAAACACTCTGMGACCAACAACC）-FAM-3'。其中PagMan探针序列的5'端有FAM荧光染料，3'端有Quencher-TAMRA荧光淬油基团。它绑定到PG6的中间段标记点另一个碱基的位点（接近PG5引物的位置），并且TaqMan荧光定量PCR反应的热循环在94°C下进行开启，85°C下扩增，并在于72°C的伸长阶段使用定量荧光PCR进行检测。
表1:PG5和PG6引物的序列
引物序列（5'-3'）
PG5TGACCTGGACATTGCACAGT
PG6GATCATGTGCTCAGCAGTGT
3、PEDVTaqMan荧光定量PCR方法的评价
3.1、灵敏度
我们评估了PEDVTaqMan荧光定量PCR方法的检测灵敏度。此方法在10-6到10-3浓度范围内对PEDV进行检测。PEDVRNA碱基序列复制数的下限为4个拷贝/ml。因此，这种方法是一种高度灵敏的PEDV检测技术。
3.2、特异性
处理其他RNA和DNA模板时，PEDVTaqMan荧光定量PCR方法的特异性得到了验证。在这种方法中，我们不仅针对PEDVN蛋白的编码基因开展PCR反应，还通过测序分析验证了PCR扩增的特异性。
3.3、实现进展和应用
PEDVTaqMan荧光定量PCR方法是一种高度灵敏和高度特异的PEDV检测技术，具有许多优点。它具有检测快速响应、高质量和直接定量样品中PEDV的特性，因此可以为PEDV的诊断、治疗和预防提供有用的参考。此外，该方法还可以用于病毒的基础研究，从而提高我们对这种病毒的理解和认知。相信，随着该方法的不断发展和完善，将对PEDV的控制和预防作出贡献，并使我们更好地适应病毒的进化和变异。