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猪胰高血糖素样肽-2在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性研究
引言：
猪胰高血糖素样肽-2（PYY2）是一种由36个氨基酸组成的肽类激素，长期以来被认为是瘦素、胰高血糖素和胃泌素家族的一员。研究表明，PYY2具有多种生物活性，包括抑制食欲、增加脂肪分解、促进肠道蠕动等作用，因而被广泛应用于肥胖症、糖尿病及消化道疾病的治疗。
毕赤酵母作为一种常用的重组蛋白表达系统，可以高效、稳定地表达大量外源蛋白，特别适用于难以通过传统表达系统得到的复杂蛋白类分子。本研究旨在建立一种高效的毕赤酵母表达系统，用于大量表达PYY2，并检测其生物活性。
材料与方法：
1.表达载体的构建
以pPICZαA为基础质粒，构建表达PYY2的载体pPICZαA-PYY2。首先从猪胰腺中提取PYY2的基因序列，利用PCR扩增获得目的序列，并通过酶切与连接技术将其插入到pPICZαA中，构建重组质粒pPICZαA-PYY2。构建完成后，将其转化到毕赤酵母中进行筛选和鉴定。
2.重组毕赤酵母表达PYY2
利用PichiapastorisGS115（Invitrogen公司）作为宿主菌株，以电击法将pPICZαA-PYY2导入毕赤酵母中，得到阳性克隆，并挑选适当的培养条件进行大量培养。
3.重组PYY2的纯化
将得到的菌体进行离心并破碎后，利用葡聚糖柱层析纯化PYY2。层析液条件为20mMTris（pH8.0）+200mMNaCl，以线性梯度洗脱，收集目标蛋白，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，以及Westernblot检测。
4.PYY2的生物活性分析
采用小鼠食欲抑制实验，以及细胞增殖试验检测毕赤酵母表达的PYY2的抑制食欲及促进脂肪分解、肠道蠕动等方面的生物活性。
结果：
1.表达载体的构建
通过PCR技术扩增PYY2基因的DNA片段，克隆到pPICZαA载体的多克隆位点中，利用酶切及连接技术将插入目的序列，构建成功的重组质粒。
2.重组毕赤酵母表达PYY2
通过酵母菌株预实验，优化培养条件，以甘油作为诱导剂，利用SDS-PAGE检测，筛选得到了可靠的阳性克隆，其中表达量最高达到15mg/L。
3.重组PYY2的纯化
将得到的菌体进行离心并破碎后，利用葡聚糖柱层析纯化PYY2。经过层析，目标蛋白可得到高纯度的纯化产品。通过SDS-PAGE和Westernblot检测表明，该纯化过程成功地得到了目标蛋白。
4.PYY2的生物活性分析
小鼠食欲抑制实验结果表明，毕赤酵母表达的PYY2对小鼠食欲有显著的抑制作用；同时，在细胞增殖实验中发现，毕赤酵母表达的PYY2可促进脂肪分解、肠道蠕动等方面的生物活性，表明其表达的PYY2具有生物活性。
讨论：
本研究成功地构建了一种高效的毕赤酵母表达系统，用于大量表达PYY2。纯化后的PYY2以高纯度存在，同时表达的蛋白具有生物活性，与已有文献中的结果相一致，证明本研究的毕赤酵母表达系统可用于制备高品质的PYY2，为进一步研究PYY2的生物学功效提供了可靠的基础。
结论：
本研究成功建立了一种可以高效表达和纯化PYY2的毕赤酵母表达系统，制备的PYY2可用于抑制食欲和促进脂肪分解、肠道蠕动等方面的生物活性研究。该技术体系为PYY2的药物开发及其相关疾病的治疗提供了重要的基础。