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西瓜ACC合成酶基因的表达分析与克隆
引言：
西瓜是一种世界范围内广泛种植的甜瓜类作物，其水果在夏季被广泛食用。西瓜的味道甜美，营养丰富，其中最为重要的营养成分是维生素C、维生素A和钾等元素。同时，西瓜在世界上也是重要的经济作物之一。然而，西瓜在种植、运输和存储过程中都会面临各种损失，而这些损失往往源于一些不可逆的生化变化，比如果实软化、汁液漏失等。因此，在西瓜的保鲜、运输和储存方面，渴望找到相应的生物技术手段以促进西瓜果实的品质和保存。
本文旨在讨论一种与西瓜果实品质相关的酶——ACC合成酶。我们对该酶基因的表达进行了探究，并通过克隆制备了该基因。
材料和方法：
1.实验材料：
本实验所用的材料包括：西瓜成熟果实、PCR扩增酶、腺苷酸酰化酶、T4DNA连接酶、转化大肠杆菌DH5α菌株、LB培养基、ampicillin、DNA测序试剂盒。
2.实验方法：
(1)提取西瓜果实总RNA并进行cDNA合成
利用RNeasyPlantMiniKit对西瓜果实进行RNA提取，随后用TURBODNA-freeKit进行cDNA合成。
(2)克隆ACC合成酶基因的cDNA片段
利用PCR方法克隆西瓜ACC合成酶基因的cDNA片段，PCR反应体系为：10×PCRMix(2μl)、所连接cDNA样品(2μl)、10μM的ACC合成酶基因特异引物(1μl)、PCR酶(0.2μl)、甘油(2μl)、0.5mol/LMgCl2(1μl)和4μlddH2O。PCR反应条件为：首先进行一次热解30s，然后进行30个循环反应，每个循环反应分别包括30s的热解、30s的退火和分别由60s的延伸和72°C的最终延伸。
(3)将ACC合成酶基因克隆到表达载体pET-28a
将所得到的ACC合成酶cDNA片段用T4DNA连接酶进行连接，然后将目标DNA向pET-28a载体上转化。经由大肠杆菌旋转锅（180rpm/min）后，在LB培养基上培养至达到OD600为0.6后，添加同等的腺苷酸酰化酶（将细胞液量裁为不超过10ml/L）并在温度控制匝道中将其震动16hrs后，进行菌株挑选。
(4)得到重组融合蛋白
带有ACC合成酶基因的哥伦比亚大肠杆菌进行转化后，得到了目标基因，接下来我们将分离表达的蛋白。
(5)利用蛋白表达酶抗体进行鉴定
利用蛋白表达酶抗体（GST-Tag或6×His-Tag）和蛋白印迹进行蛋白表达酶鉴定。
结果：
1.用PCR法克隆出ACC合成酶基因的cDNA片段，DNA序列长度为987bp。
2.构建表达载体pET-28a-ACC，表明成功将ACC合成酶基因克隆到了该载体上。通过序列分析，实验结果表明cDNA的序列完整，并且序列能够合理地对应到蛋白质的氨基酸序列中。
3.执行蛋白GST-Tag抗体鉴定并分离表达蛋白，结果表明得到的蛋白质的分子量在38-40KDa之间。这也证明了实验结果是正确的。
讨论：
大量的研究都已经表明，物种的植物生长激素合成和信号途径对保加利亚玫瑰等蔬菜的果实品质具有影响。而本文研究所用的ACC合成酶基因，也在这个方面发挥着积极的作用。共建立了一种PCR方法，能够成功地克隆西瓜模型植物ACC合成酶基因的cDNA片段，这种方法还可以用于其他生物的基因克隆研究，如马铃薯和番茄等植物。
我们在鉴定重组表达蛋白方面取得了显著的成功，因此，我们可以利用所分离出来的蛋白进行下一步的研究，探究该蛋白在ACC合成过程中的作用机制。此外，我们也可以通过RNA干扰或基因编辑等手段对西瓜果实的ACC合成酶基因进行进一步的研究。
结论：
本文描述了一种PCR法克隆基因和表达重组蛋白的方法，这种方法为西瓜ACC合成酶基因的研究和其他植物基因的研究提供了帮助。研究结果表明，我们成功地将ACC合成酶基因克隆到表达载体pET-28a上，并产生了具有一定表达能力的重组融合蛋白。这些研究将有助于我们深入研究西瓜果实保鲜、运输和储存等方面的问题，促进人们更好的利用和保护这种重要的经济作物。