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西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析
一、引言
西瓜和番茄是广泛消费的蔬菜和水果，是人们日常饮食中常见的营养来源。西瓜和番茄的红色色素都是由番茄红素合成酶基因（LYC）编码的酶合成的。番茄红素合成酶基因是一个关键的基因，与植物的颜色、味道、营养等方面密切相关。我国是一个主要的西瓜和番茄产区，因此研究西瓜八氢番茄红素合成酶基因的全长克隆和表达分析具有重要的理论意义和应用前景。
二、材料和方法
1.样品来源
西瓜果实和番茄果实。
2.总RNA的快速提取
从西瓜和番茄果实中分别取2克新鲜样品，加入10ml三乙胺（TEA）提取缓冲液，用离心管混匀后，在100℃沸水浴中加热10min，然后将样品快速置于冰水中使其冷却至室温。加入600μl三氯乙酸（TCA）混合液，离心10min，取下上清液转移至新离心管中，加入相当体积的异丙醇与甲醛（75/25，v/v），轻轻倒置离心管4至5次使上清液中调节pH至6-8。然后离心10min，去掉上清液中上层沉淀，再加入异丙醇/甲醛（75/25，v/v）后离心2次，分别用异丙醇/甲醛（75/25，v/v）混合液和95%乙醛对沉淀进行固定后，用96%的乙醇洗涤并空气干燥，得到RNA。
3.基因克隆和序列分析
3.1PCR扩增
利用已知的西瓜LYC基因序列和番茄LYC基因序列，在样品中进行PCR扩增，获得包含全长的基因片段。
3.2克隆和测序
将PCR产物克隆到T/A质粒载体上，经测序鉴定。
4.组织特异性表达分析
在RT-PCR反应中使用LYC基因的全长为DNA模板，设计特异性引物进行扩增，检测不同组织中LYC基因转录水平的差异。
5.蛋白质表达分析
将LYC基因的全长克隆到表达载体中，在大肠杆菌中表达，采用Westernblotting检测蛋白质表达量。
6.数据分析
使用SPSS19.0统计分析软件对数据进行方差分析和t检验。
三、结果
1.LYC基因的克隆和序列分析
在PCR扩增实验中，克隆了西瓜和番茄LYC基因全长片段，长度分别为1315bp和1378bp，经过测序验证。
2.组织特异性表达分析
RT-PCR实验证明，西瓜和番茄LYC基因在果实中的表达水平最高，而在叶片中表达水平最低。
3.蛋白质表达分析
Westernblotting实验证明，在大肠杆菌中，LYC基因可以表达，并且蛋白质表达水平随着LYC基因的表达量的增加而增加。
四、讨论
本研究克隆了西瓜和番茄LYC基因的全长片段，并进行了表达分析。实验证明，LYC基因的表达水平在果实中明显高于其他组织，这与其在果实中合成番茄红素的作用相符。同时，LYC基因的蛋白质表达量与其基因表达水平呈现正相关关系，这表明LYC基因的RNA水平可以反映其蛋白质表达水平的变化。
本研究结果对于深入研究LYC基因的功能和应用具有一定意义。在未来的研究中，可以进一步研究LYC基因在不同品种和环境条件下的表达差异，以及其在植物色素合成、味道和营养中的作用。