苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定.docx

苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定
题目：苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定
摘要：
苏云金芽孢杆菌010菌株是一种常见的细菌，其chi36基因被认为是编码了一种具有明显水解酶活性的酶。本研究利用PCR技术对chi36基因进行了克隆，将其转化至大肠杆菌BL21中表达，然后对表达产物进行纯化和酶活性检测。结果表明，我们成功克隆、表达和纯化了chi36基因产物，并观察到其水解乳糖的活性。因此，本研究为深入研究苏云金芽孢杆菌010菌株的酶学特性和其在生物技术中的应用奠定了基础。
关键词：苏云金芽孢杆菌010菌株，chi36基因，PCR克隆，酶活性检测，表达纯化
Abstract:
Bacillussubtilis010isacommonbacterium,anditschi36geneisconsideredtoencodeanenzymewithobvioushydrolyticactivity.Inthisstudy,weclonedthechi36geneusingPCRtechnology,expresseditinE.coliBL21,andthenpurifiedandtestedtheenzymaticactivityoftheexpressionproduct.Theresultsshowedthatwesuccessfullycloned,expressed,andpurifiedthechi36geneproduct,andobserveditsactivityinhydrolyzinglactose.Therefore,thisstudylaidthegroundworkforfurtherresearchontheenzymaticcharacteristicsofBacillussubtilis010anditsapplicationsinbiotechnology.
Keywords:Bacillussubtilis010,chi36gene,PCRcloning,enzymaticactivitytest,expressionandpurification.
正文：
1.引言
苏云金芽孢杆菌010菌株是广泛存在于自然界的一种细菌，其具有很强的代谢能力和产生多种基因产物的能力，因此在工业和农业生产中具有广泛的应用价值。在生物技术的研究中，注重对苏云金芽孢杆菌010菌株的酶学特性进行研究，尤其是对其代谢酶的研究，这对于提高菌株的产生能力和开发新型的酶剂等都具有重要意义。其中，chi36基因被认为是编码了一种具有明显水解酶活性的酶，现代基因克隆技术的发展，为chi36基因的研究提供了有力的手段。本研究旨在对苏云金芽孢杆菌010菌株的chi36基因进行克隆、表达和酶活性测定，以期为其在生物技术中应用奠定基础。
2.材料和方法
2.1菌株和质粒
本实验使用苏云金芽孢杆菌010菌株和大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主，pET-28a(+)作为表达质粒。
2.2PCR克隆
采用苏云金芽孢杆菌010菌株总DNA为模板，使用反向和正向寡核苷酸引物设计chi36基因的PCR扩增方法。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，68℃1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，反复30个循环。（反向引物：5'-acgtctpnagtmgnccrtncc-3'，正向引物：5'-catatggnacctggaaccaaa-3'）
2.3构建表达质粒
将PCR扩增的chi36基因克隆至pET-28a(+)表达质粒的多克隆位点上（NdeI和XhoI酶切位点），并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
2.4蛋白表达和纯化
将含有chi36基因的大肠杆菌BL21(DE3)转化物接种至LB培养基中（含适当浓度的氨苄青霉素），过夜培养至菌液OD600约为0.6-0.8时，加入1mM/LIPTG进行诱导表达，静置37℃，200rpm，3~4h，将表达产物收集并通过Ni2+柱层析纯化。
2.5酶活性测定
将克隆、表达并纯化的chi36表达产物与乳糖混合，12℃下反应30分钟，以此来检测其水解乳糖的活性。
为验证重组蛋白具有催化乳糖水解的能力，将克隆表达后纯化的chi36蛋白在含有100mMTris-HCl,pH7.0,3mMCaCl2,6mMMgSO4,和100mM乳糖的介质中活性测定。
3.结果
3.1chi36基因的克隆和表达
成功从苏云金芽孢杆菌010菌株中扩增了目标基因chi36，并将其克隆至表达载体pET-28a中。然后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达。利用SDS-PAGE对表达菌株的细胞色素进行比较，发现诱导后的菌株中出现了一条明显的表达带，其分子量与预期相同，