苏云金芽孢杆菌菌株.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114901800A(43)申请公布日2022.08.12(21)申请号202080058610.0(72)发明人J·卡巴耶罗桑切斯(22)申请日2020.06.14(74)专利代理机构中国贸促会专利商标事务所(30)优先权数据有限公司1103819382497.62019.06.14EP专利代理师李程达(85)PCT国际申请进入国家阶段日(51)Int.Cl.2022.02.14C12N1/20(2006.01)C12Q1/04(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据A01N63/23(2020.01)PCT/EP2020/0664182020.06.14A01N63/50(2020.01)(87)PCT国际申请的公布数据A01N37/46(2006.01)WO2020/249811EN2020.12.17A01P7/04(2006.01)C12R1/07(2006.01)(83)生物保藏信息CECT97532018.11.08(71)申请人生物昆虫有限公司权利要求书3页说明书30页地址西班牙纳瓦拉序列表72页PCT/RO/134表1页附图15页(54)发明名称苏云金芽孢杆菌菌株(57)摘要本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，其不产生β‑外毒素，并且对草地贪夜蛾表现出杀虫活性，草地贪夜蛾是一种用目前市场上可用的基于Bt的产品控制很差或无效的昆虫。因此，基于该菌株的组合物可用作杀虫剂或用于制备杀虫剂，优选地使用的组合物是该菌株的孢子和晶体蛋白的组合。该菌株的基因组包含至少6个不同的cry基因和至少3个不同的vip基因的组合，尚未在其他Bt菌株中描述过并可用于对其进行鉴定。CN114901800ACN114901800A权利要求书1/3页1.一种苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株，其特征在于：所述菌株是菌株SVBS‑1801，其保藏在ColeccióndeCultivosTipo(CECT)，保藏参考号为CECT9753。2.一种制备包含权利要求1的SVBS‑1801菌株的晶体和孢子的混合物的组合物的方法，其包括以下步骤：a)培养SBVS‑1801细菌，直到超过50％的细菌细胞已经发生孢子形成、已经裂解并将其晶体和孢子释放到培养基中；b)通过引起晶体和孢子从它们悬浮的培养基中沉降来纯化晶体和孢子，优选地通过离心来纯化，并收集沉淀物；c)任选地，用蛋白酶抑制溶液洗涤沉淀物并再次引起晶体和孢子的沉降；d)在以下条件储存纯化的晶体和孢子：a.在室温，在已经将步骤b)或c)中获得的沉淀物冻干后，或b.在‑18°至‑20℃或更低的间隔的温度，在已经将b)或c)中获得的沉淀物重新悬浮在水或水溶液中后。3.一种获得权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的纯化的晶体的方法，其包括以下步骤：i)用1MNaCl洗涤权利要求1的菌株的晶体和孢子的混合物，并以9000g离心10min，ii)收集团块并将其重新悬浮在PBS中，iii)向步骤ii)中获得的悬浮液中加入己烷并涡旋；iv)将iii)的悬浮液以6000g，4℃，离心10min，v)重复步骤ii)至iv)至少三次，vi)收集在v)中获得的晶体团块并在冷蒸馏水中洗涤3次。4.一种组合物，其包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的：a)营养细胞，b)含有孢子的细菌细胞，c)孢子，d)晶体，e)孢子、晶体和晶体蛋白的混合物，f)不包含在晶体中的Cry蛋白，g)至少一种Vip蛋白，或其组合，其中，当a)至e)中定义的组中的成员不存在时，a.组合物包含至少一种不包含在晶体中的Cry蛋白，并且至少SEQIDNO:8的蛋白质存在于组合物中，和/或b.SEQIDNO:14、SEQIDNO:16和SEQIDNO:18的蛋白质的组中的所有三种Vip蛋白质都存在于组合物中。5.根据权利要求4的组合物，其中组合物另外包含在权利要求2的方法的步骤b)中获得的部分上清液。2CN114901800A权利要求书2/3页6.根据权利要求4或5的组合物，其至少包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的以下之一：a)孢子和晶体的混合物，b)在权利要求2的方法的步骤b)中获得的孢子、晶体和部分上清液的混合物，c)晶体，d)在权利要求2的方法的步骤b)中获得的晶体和部分上清液。7.根据权利要求6的组合物，其包含权利要求2的方法的步骤b)中获得的晶体或晶体和部分上清液的混合物，其中晶体已经通过权利要求3的方法预先纯化并且组合物基本上不含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的孢子。8.根据权利要求4的组合物，其至少包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的孢子、晶体和晶体蛋白的混合物。9.根据权利要求4的组合物，其包含不包含在晶体中的Cry蛋白，并且其中组合物包