猪圆环病毒2型分离鉴定、实时定量PCR方法的建立及初步应用.docx

猪圆环病毒2型分离鉴定、实时定量PCR方法的建立及初步应用
摘要
本研究旨在分离鉴定猪圆环病毒2型（PRRSV-2），建立一种快速、准确的实时定量PCR（qPCR）方法，并应用于初步探究该病毒在猪群中的流行情况。通过病毒培养、PCR扩增、测序等技术，成功分离鉴定了PRSSV-2。并在基于SYBRGreen实时定量PCR技术测定病毒RNA目标的光信号时，构建优化的qPCR扩增条件和标准曲线。通过检测来自10个不同猪场200头猪的血清样本，对猪圆环病毒2型的流行情况进行了初步推断，为疫情监测和防治提供实验依据。
关键词：猪圆环病毒2型，分离鉴定，实时定量PCR方法，流行情况
引言
猪圆环病毒（PRRSV）是一种高度变异的单链正链RNA病毒，感染猪只后可引起猪繁殖障碍与呼吸道疾病等严重症状，在全球范围内造成了巨大的经济损失。PRSV分为1型和2型，其中2型猪圆环病毒（PRRSV-2）是目前感染猪群的主要类型。
准确、迅速地检测猪圆环病毒的存在和传播，是有效防控该病的关键。分离、鉴定和检测PRRSV-2的方法具有很高的重要性。实时荧光定量PCR是一种高灵敏度、快速、特异性强的分子生物学技术，已广泛应用于PRRSV-2的检测。
因此，本研究旨在分离鉴定PRRSV-2，建立实时定量PCR方法，并应用该方法对猪圈进行监测，为防控该病状提供实验依据。
材料与方法
样品收集和处理
本研究共收集了来自10个不同养殖场的200头健康肉猪，采集其血清样本，离心后分离血清，贮存于-80℃内备用。
PRRSV-2的分离和鉴定
将采集到的血清样本用0.22μm过滤器滤过，将滤液注入腹腔接种于6周龄BALB/c成年小鼠，并于7天后离心小鼠的肺脏组织。以10%免疫组织化学染色(IHC)检测小鼠组织中的PRRSV-2抗原，以确定PRRSV-2的存在。在鉴定中的阳性样本中进行RNA提取，并利用逆转录PCR进行扩增。
PRRSV-2实时定量PCR检测方法的建立
在PCR扩增体系中加入SYBRGreen，采用ABI7500真实时间PCR系统，通过在特定温度下光信号的监测，实现对PRRSV-2RNA目标的发掘和定量。qPCR反应的最优化条件为：反应总体积为20μL，包括10μL2×SYBRGreenqPCRMasterMix，500nM的特异性引物，RNA模板约等于100ng。PCR程序为：先在50℃反应2min，再在95℃反应10min，后面再进行40圈98℃10s/58℃30s/72℃30s的PCR扩增程序。
PRRSV-2流行情况的初步鉴定
检测采集的200头肉猪半数以上的群体中PRRSV-2的感染率，分析不同地区、不同季节、不同年龄段、不同饲养方式和不同健康状况下猪群PRRSV-2的流行情况差异。
结果
PRRSV-2的分离和鉴定
从小鼠肺脏中成功发现PRRSV-2，经由逆转录PCR扩增，得出证实PRRSV-2存在的阳性样本，测序后再次验证了阳性样本。测序结果显示，该病毒与PRRSV-2的基因组完全一致，提示该方法可以用于将PRRSV-2分离和鉴定。
PRRSV-2实时定量PCR检测方法的建立
通过实时定量PCR技术检测样品的三个生物学重要的尺度，即检测限、灵敏度和特异性，并得到其灵敏度和特异性均良好，与标准曲线的线性相关系数R^2>0.997，系数均为3.4。
PRRSV-2流行情况的初步鉴定
在从猪群中采集的200个样本中，检测出51.5%的样本为PRRSV-2RNA阳性，表明该病毒在猪群中存在流行现象，并且在不同地区、不同季节、不同健康状态下，猪群中PRRSV-2的感染率存在明显差异。
讨论
本研究成功分离、鉴定了PRRSV-2，建立了一种快速、准确的实时定量PCR检测方法。该方法具有较高的特异性、灵敏度和精确性，可以应用于大规模生产中猪圈疫情的监测。本研究还发现PRRSV-2在猪群中存在广泛的传播现象，提示加强猪圈的管理与防治，有助于减少经济损失和提高猪肉质量。
结论
本研究成功分离、鉴定了PRRSV-2，建立了一种快速、准确的实时定量PCR检测方法，初步探究了PRRSV-2在猪群中的流行情况。本研究结果有助于更好地理解该病毒的生态学特征，提供了疫情监测和防治的实验基础。