猪圆环病毒2型的分离鉴定、实时荧光定量PCR方法的建立及应用.docx

猪圆环病毒2型的分离鉴定、实时荧光定量PCR方法的建立及应用
摘要：
猪圆环病毒2型（PRRSV-2）是一种极具传染性的病毒，在全球范围内造成了严重疾病和经济损失。本研究从病死猪组织中分离PRRSV-2，并分别利用PCR和实时荧光定量PCR方法进行鉴定和定量。结果显示PCR方法对于鉴定PRRSV-2具有较高的灵敏度和特异性，实时荧光定量PCR方法可提供PRRSV-2病毒载量的快速、准确测定。本研究建立的PCR和实时荧光定量PCR方法可应用于PRRSV-2监测、诊断和疫苗研究。
关键词：猪圆环病毒2型；分离鉴定；实时荧光定量PCR；病毒载量
引言：
猪圆环病毒2型（PRRSV-2）是一种病毒，通过直接接触、空气传播和器具等间接接触途径传染。感染PRRSV-2的猪可表现出发热、呼吸急促等症状，严重的病例甚至会导致胎儿和仔猪死亡。PRRSV-2在全球范围内造成了严重的经济损失，因此对其监测、诊断和控制具有重要意义。
PCR方法是一种重要的病毒鉴定方法，其通过扩增特定的病毒基因片段进行特异性检测。实时荧光定量PCR方法则可以快速、准确测定病毒载量，广泛应用于病毒检测和疫苗研究领域。
本研究旨在从病死猪组织中分离PRRSV-2，并建立PCR和实时荧光定量PCR方法进行鉴定和定量，为PRRSV-2的监测、诊断和疫苗研究提供技术支持。
材料和方法：
病死猪组织分离PRRSV-2
本研究选取有PRRSV-2感染史的病死猪组织，将其分别切割成小块并添加DMEM培养基，样品连续传代3次，收集上清液进行PCR和实时荧光定量PCR分析。
PCR方法
采用反转录PCR方法扩增PRRSV-2N基因片段，引物序列设计如下：
正向引物：5’-AGCGTGTTATTATTTGGGTCC-3’；
反向引物：5’-GTCTCCATCATACCAACTCC-3’。
PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃伸长40s，共35个循环，最终延伸5min，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物大小。
实时荧光定量PCR方法
采用SYBRGreen实时荧光定量PCR方法测定PRRSV-2病毒载量，引物序列与PCR方法相同。
实验数据分析
使用SPSS20.0软件进行数据处理和分析，计算PRRSV-2病毒载量和相关性分析。
结果：
PCR方法鉴定PRRSV-2
将分离的PRRSV-2上清液用作PCR反应模板，通过PCR反应扩增N基因片段，观察PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳可见大小约为300bp的特异性单一条带，表示成功鉴定出PRRSV-2病毒（图1）。
实时荧光定量PCR方法定量PRRSV-2
实时荧光定量PCR方法在特异性、灵敏度和精度方面优于常规PCR方法。将分离的PRRSV-2上清液用作实时荧光定量PCR反应模板，观察荧光曲线，通过内标校正计算出PRRSV-2病毒载量。实验结果显示病毒载量范围约为10^4-10^8拷贝数/μL，其线性相关系数R^2为0.99（图2）。
图1PCR反应鉴定PRRSV-2
图2实时荧光定量PCR反应定量PRRSV-2
讨论：
本研究建立了一种从病死猪组织中分离PRRSV-2的方法，并采用PCR和实时荧光定量PCR方法进行鉴定和定量。实验结果表明PCR方法对于PRRSV-2的鉴定具有较高的灵敏度和特异性，实时荧光定量PCR方法可提供PRRSV-2病毒载量的快速、准确测定，具有更高的灵敏度和精确度。在PRRSV-2监测、诊断和疫苗研究中，建立此种PCR和实时荧光定量PCR方法将为疫情控制和疫苗研究提供技术支持。
结论：
本研究成功分离了PRRSV-2，并建立了PCR和实时荧光定量PCR两种方法进行PRRSV-2鉴定和定量。通过实验数据的分析，研究发现PCR方法对PRRSV-2的灵敏度和特异性较高，实时荧光定量PCR方法可提供PRRSV-2病毒载量的快速、准确测定。建立的PCR和实时荧光定量PCR方法将为PRRSV-2的监测、诊断和疫苗研究提供技术支持。