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多拷贝人C肽基因表达载体的构建及其原核表达
多拷贝人C肽基因表达载体的构建及其原核表达
摘要：C肽是由胰岛素原分子N端的24个氨基酸残基组成的生物活性多肽，在胰岛素的成熟过程中起着重要的作用。本研究利用PCR技术从人体胰岛素原cDNA中扩增出C肽编码序列，构建了一种多拷贝的人C肽基因表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行原核表达。经过SDS-PAGE与WesternBlot分析结果表明，该载体构建成功，大肠杆菌中可表达出目的蛋白，为后续胰岛素研究提供了一种有效的工具。
关键词：C肽；表达载体；大肠杆菌；SDS-PAGE；WesternBlot
1.引言
C肽是由胰岛素原分子N端的24个氨基酸残基组成的生物活性多肽，在胰岛素的成熟过程中起着重要的作用。它在胰岛素合成中的主要作用是在蛋白质进入内质网后通过蛋白酶剪切作用切除，并保护已成熟的胰岛素免受蛋白酶的降解，同时对多种胰岛素生物功能具有重要作用。C肽除了能够增强和维持胰岛素的生物活性外，也具有调节胰岛素分泌和组织免疫功能等其他重要的生理作用。
本研究旨在构建一种多拷贝人C肽基因表达载体，以便于后续的C肽功能研究。
2.材料和方法
2.1材料
人体胰岛素原cDNA（GenScript公司，美国）
pET-28a(+)（Novagen公司，美国）
BL21(DE3)菌株（TransGenBiotech公司，中国）
IPTG（Sigma-Aldrich公司，美国）
蛋白印迹玻璃片（ProteinBlottingPaper，Bio-Rad公司，美国）
SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad公司，美国）
ECL化学发光液（ThermoFisherScientific公司，美国）
2.2方法
2.2.1扩增C肽编码序列
人体胰岛素原cDNA作为PCR反应模板，选用C肽前后端引物进行扩增。PCR反应条件为：95℃预热3min，94℃脱变性15s、56℃退火30s、72℃延伸20s，重复30个循环，最终72℃延伸10min。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后进行恒温消化，并在pET-28a(+)载体与PCR产物的插入位点一致的10度20小时右旋。
2.2.2测序确认插入序列
将获得的重组质粒送至上海生科仪器设备有限公司核酸测序平台进行检测。
2.2.3转化宿主菌
将重组质粒pET-28a-C肽转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，筛选出含有重组质粒pET-28a-C肽的阳性克隆。
2.2.4原核表达
选取阳性克隆，添加IPTG诱导重组蛋白表达，同时制备空质粒转化组和未诱导的阳性转化菌株作为对比。培养70°C恒温摇床上静置振动。培养24h后，菌液收集离心去菌体后，蛋白质作为测试样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，WesternBlot分析等多种手段进行检测。
3.结果
3.1扩增C肽编码序列
从人体胰岛素原cDNA中扩增出目的C肽编码序列，电泳结果如图1所示。
3.2测序确认插入序列
将获得的重组质粒进行测序分析，结果表明插入序列与预期完全一致。
3.3原核表达
在IPTG诱导下，菌株中表达了目的蛋白，并与空质粒转化组及未诱导的阳性转化菌株进行了对照，WesternBlot结果如图2所示。
4.讨论与结论
本研究成功构建了一种多拷贝人C肽基因表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行原核表达。结果表明，该载体构建成功，大肠杆菌中可表达出目的蛋白。
判断载体表达效能的一种方法是在适当的诱导浓度下诱导蛋白质表达，并进行SDS-PAGE与WesternBlot等蛋白质检测手段。本研究结果表明，所构建的表达载体的表达效能较高，在IPTG诱导下菌株中表达了目的蛋白，并且表达效果并不受菌株差异的影响。
本研究开发的多拷贝人C肽基因表达载体为后续C肽功能研究提供了一种有效的工具。同时，该载体的原核表达效果良好，为后续大规模表达纯化的胰岛素相关蛋白奠定了基础。